肺腺癌表达TRPM8蛋白的意义*

马洪明， 黄远顺， 黄妙灵， 张 苗， 陈 洋， 黄志宏，崔 淼， 梁婉玲， 刘升明， 蔡兴东△

（1暨南大学附属第一医院呼吸内科，广东广州510630；2暨南大学生命科学技术学院，广东广州510632）

肺癌目前仍然是全世界范围内导致肿瘤性死亡的首要原因［1］。2018年，全球新发肺癌病例约210万，死亡病例约180万［1］。目前男性肺癌患者的发病率呈下降趋势，但在女性中，肺癌的发病率呈上升并年轻化趋势［2-3］。肺癌目前5年累积生存率约为18%，但仍然有一半以上的肺癌患者在确诊时已经处于晚期，其5年累积生存率仅为4%左右［4］，主要是由于肺癌的发生发展机制不清楚，仍需探索相关治疗和预后预测的靶点。

瞬时受体电位（transient receptor potential，TRP）通道是一类阳离子通道，参与了机体多种生理活动，其中TRPM8属于TRPM亚家族，被激活后可引起细胞Ca2+内流，Ca2+作为第二信使调控细胞增殖、运动、凋亡等生物学行为。研究表明，TRPM8在前列腺癌［5］、胰腺癌［6］和膀胱尿路上皮癌［7］中高表达，与患者的不良预后有关。TRPM8影响Lewis肺癌细胞的黏附、移动和侵袭能力［8］。但在肺腺癌中TRPM8的表达及其临床意义尚无文献报道，因此本研究通过检测TRPM8在肺腺癌组织中的表达，分析其与患者临床特征的关系，并通过上调肺腺癌细胞中TRPM8的表达分析其对肺腺癌细胞生物学行为的影响。

材料和方法

1 患者临床资料、组织标本收集及分析

1.1 患者组织标本、临床资料收集及随访 收集暨南大学附属第一医院2007～2012年病理确诊肺腺癌患者112例，包括75例肺腺癌及匹配的癌旁组织，癌旁组织定义为肺癌切缘外3 cm处肺组织。其中男66例，平均年龄（59.9±10.6）岁，女 46例，平均（59.8±11.1）岁。所有患者均签署知情同意书，并经暨南大学附属第一医院伦理委员会批准进行研究。术前均未经放疗及化疗，所有患者术后病理证实为腺癌或支气管肺泡癌。根据国际肺癌研究学会肺癌第7版TNM分期标准进行分期，所有患者随访至死亡或4～5年。

1.2 组织标本免疫组织化学染色分析 采用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法进行免疫组织化学染色，分析TRPM8在肺腺癌及癌旁组织中的表达。HE染色常规显示肺实质及间质细胞。兔抗TRPM8多克隆抗体（LifeSpan Biosciences）按 1∶200稀释，HRP 标记的羊抗兔 IgG（Boster）。采用SP超敏试剂盒，按照说明书操作，以PBS代替I抗，做空白对照。免疫组织化学结果由两位病理科医师分别双盲阅片判定。TRPM8在肺腺癌切片中表达强度参考文献［9-10］评分。染色强度评分如下：0分（无染色），1分（轻度染色：浅黄色），2分（中度染色：黄棕色），3分（重度染色：棕色）。染色阳性细胞数评分如下：0分（无染色阳性细胞），1分（＜10%阳性细胞），2分（10～50%阳性细胞），3分（＞50%阳性细胞）。染色指数=染色阳性细胞数×染色强度，共记为0、1、2、3、4、6和9分。表达高低的最佳截断值基于log-rank检验分析肺腺癌患者病理组织中TRPM8蛋白表达与患者预后关系来界定。其中染色指数≤4为低表达，＞4为高表达。

2 细胞实验

2.1 通过慢病毒感染上调A549和H1299细胞TRPM8表达 人肺腺癌细胞A549和H1299购自中国科学院上海细胞库，以含有10%胎牛血清（Gibco BRL）、1×105U/L青霉素及100 mg/L链霉素的DMEM培养液（Gibco BRL）培养，置于5%CO2、37℃培养箱，每2 d更换培养液1次。含重组人TRPM8基因（NM_024080.4）慢病毒颗粒及对照空载体慢病毒颗粒购自吉凯基因，该病毒携带筛选基因EGFP及嘌呤霉素。A549及H1299细胞感染病毒72 h后以10µg/L嘌呤霉素（Sigma）终浓度筛选3周，荧光显微镜下可见均带有EGFP的细胞，提示筛选成功。筛选成功后提取细胞总RNA，以T100 PCR仪（Bio-Rad）扩增，循环参数如下：95℃ 30 s；95℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃30 s，共35个循环。TRPM8上游引物序列为5′-GAAAACACCCAACCTGGTCATTTC-3′，下游引物序列为 5′-CACCGTGCGGGGTAAAAAGCG-3′；内参照GAPDH上游引物序列为5′-TTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′，下游引物序列为 5′-TGCTGTTGAAGTCAGAGGAGAC-3′。凝胶电泳鉴定PCR产物。同时提取细胞总蛋白，按KeyGene蛋白提取试剂盒说明书进行操作。以10%SDS-PAGE分离蛋白后转印于PVDF膜（Milipore）上。然后以5%的脱脂奶粉封闭1小时，分别剪开PVDF膜（TRPM8，120 kD；GAPDH，45 kD），在4℃冰箱中分别孵育兔抗TRPM8抗体（1∶200，LifeSpan Biosciences）及 GAPDH 抗体（1∶3 000，Boster）过夜，PBST洗膜5次后以HRP交联的鼠抗兔II抗（CoWin Biosciences）室温孵育1 h，PBST洗膜3次后滴入ECL发光液进行显色并曝光拍片，保存以备分析。

2.2 CCK-8法及集落形成试验 （1）将稳定表达TRPM8蛋白的A549细胞、空载体细胞和亲本细胞按每孔8×103个接种至96孔板中，每组设置3个复孔。培养24 h后加入CCK-8（Dojindo），按试剂说明书进行操作，每次加入CCK-8试剂1 h后在酶标仪450 nm波长处读A值。测定细胞接种后24、48、72、96、120、144和168 h的A值。（2）将对数生长期上述3组细胞用0.25%胰酶消化并吹打成单个细胞，按培养皿4×104个接种培养，每2 d更换培养液一次，待细胞形成显著的细胞集落后以结晶紫染色，每组重复实验3次，统计3组细胞集落数的差异。

2.3 细胞划痕试验 在6孔板背面划横线标记，将稳定表达TRPM8蛋白的A549细胞、空载体细胞和亲本细胞按每孔8×103个接种至标记6孔板中，培养24 h后细胞量达90%～95%时，用200µL吸头及灭菌直尺垂直于6孔板的板底逐个依次划痕，吸去旧培养液，用PBS轻轻洗涤3次，洗去脱落的细胞碎片，各孔加入2%高糖培养液3 mL，拍照并记录为0 h图像，继续培养，间隔8h后再取出拍照，记录迁移距离，分别记录为8、16和24 h图像，每组重复实验3次，应用ImageJ软件分析，并统计结果。

2.4 Transwell实验 Transwell小室充分水化2 h，上室分别加入200µL稳定表达TRPM8蛋白的A549细胞、空载体细胞和亲本细胞的细胞悬液（1×108/L），下室加入10%完全培养液500µL，放入原培养箱中培养，24 h后取出，PBS清洗2次，用棉签轻轻拭去未穿透的细胞，结晶紫染色液染色15 min，流水缓慢淋洗，室温晾干，显微镜下选择3个视野拍照并保存，应用Image-Pro Plus 6.0软件进行计数，并统计分析。

2.5 细胞周期及凋亡检测 （1）培养稳定表达TRPM8的A549细胞和空载体A549细胞，培养至对数生长期后进行流式细胞术检测，具体方法参考文献［11］。记录细胞在激发波长为488 nm处所得红色荧光，重复实验3次，分析不同组在细胞周期分布中的差异。（2）将上述2组细胞在6孔板中培养至对数生长期，以annexin V-FITC及PI双染色试剂（BD）进行染色后通过流式细胞术检测早期和晚期凋亡情况，具体方法参考文献［12］，重复实验3次。

2.6 C57/BL6N重度联合免疫缺陷小鼠移植瘤实验 选取5只雌性C57/BL6N重度联合免疫缺陷小鼠，将稳定表达TRPM8的H1299细胞（H1299-TRPM8）及其对照空载体细胞（H1299-control）培养至对数生长期，用PBS重悬后将100µL含1×107个细胞的悬液分别接种至4周大小C57/BL6N小鼠左右臀部皮下，左侧臀部皮下接种H1299-control，右侧臀部皮下接种H1299-TRPM8，继续饲养观察。待成瘤后用游标卡尺测量肿瘤大小，每周测量1次，计算肿瘤体积（=0.5×长径×短径2），并绘制肿瘤增殖曲线。饲养6周后脱颈处死裸鼠，剥离肿瘤组织并称重。

3 统计学处理

使用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（mean±SD）表示。TRPM8蛋白表达在各临床参数之间的差异分析采用Mann-Whitney U检验；多组间均数比较采用单因素方差分析（oneway ANOVA）；两组间均数比较采用独立样本t检验；采用Kaplan-Meier法及log-rank检验分析肺腺癌患者TRPM8不同表达组累积生存率的差异；单因素和多因素Cox回归模型分析影响肺腺癌患者预后的危险因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 肺腺癌患者肿瘤组织中TRPM8蛋白表达情况及对患者预后的影响

免疫组化染色结果显示，TRPM8在肺腺癌及癌旁组织中均有表达，在肺癌组织中主要定位于癌细胞的胞质中，而癌旁组织中主要定位于肺泡间质巨噬细胞的胞质中，见图1。患者临床特征和以染色指数区分的TRPM8高、低表达情况见表1。log-rank检验结果显示，肺腺癌患者总体生存时间在TRPM8蛋白不同表达组存在显著差异（P=0.017），见图1F。Kaplan-Meier分析显示，TRPM8低表达组患者4～5年累积生存率为37.52%（95%CI：0.241～0.412），TRPM8高表达组患者4～5年累积生存率为69.82%（95%CI：0.513～0.874）。TRPM8低表达的患者肿瘤最大径为（4.29±1.84）cm，而TRPM8高表达的患者肿瘤最大径为（3.56±1.60）cm，差异有统计学意义（P=0.028），见图1G。

Figure 1.The expression of TRPM8 protein in tumor tissues was correlated with the overall survival time and the tumor size of the patients with lung adenocarcinoma.A～C：strong，moderate and negative immunohistochemical staining of TRPM8 in lung adenocarcinoma tissues，respectively（scale bar=100µm）；D，E：a lung adenocarcinoma tissue section immunostained with PBS（negative control）and TRPM8 antibody，respectively（scale bar=100 µm）；F：the overall survival time of patients with lung adenocarcinoma was significantly different between high and low TRPM8 expression groups（P=0.017）；G：maximum tumor diameter（MTD）of the patients with lung adenocarcinoma was significantly different between high and low TRPM8 expression groups（P=0.028）.Mean±SD.图1 TRPM8在不同肺癌患者肿瘤组织中的表达及其与患者预后和肿瘤最大径的关系

2 TRPM8表达与肺腺癌患者临床特征的关系

分析TRPM8蛋白表达在肺腺癌患者临床参数之间的差异，结果显示，随着肿瘤T分期的递增，高表达TRPM8者呈减少趋势（P＜0.05），而M0期高表达TRPM8者比M1期多（P＜0.05），不同年龄段、性别、分化程度、临床分期和N分期的TRPM8表达差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

3 TRPM8低表达是肺腺癌患者预后不良的独立危险因素

单因素Cox回归分析显示，TRPM8蛋白表达水平、临床病理分期和TNM分期均为影响肺腺癌患者预后的有意义变量（P＜0.05）；多因素Cox回归分析显示，TRPM8蛋白表达水平和肿瘤是否发生远处转移是导致患者预后不良的独立危险因素：TRPM8低表达患者的死亡风险较高表达TRPM8患者增加2.33倍（95%CI：1.109～4.878，P＜0.05），发生肿瘤远处转移的患者，其死亡风险较未发生远处转移者高5.32倍（95%CI：1.531～18.490，P＜0.05），见表3。

4 过表达TRPM8对A549细胞增殖能力的影响

首先，通过慢病毒感染稳定上调A549细胞中TRPM8蛋白的表达，RT-PCR及Western blot显示成功上调A549细胞中TRPM8 mRNA及蛋白的表达，见图2A、B。CCK-8法结果显示，过表达TRPM8后，相对于空载体和亲本细胞组，A549细胞活力显著下降（P＜0.01），见图2C。集落形成实验结果显示，过表达TRPM8后，A549细胞形成的集落数较亲本和空载体组减少（P＜0.01），见图2D。

表1 112例肺腺癌患者临床特征Table 1.The clinical characteristics of 112 patients with lung adenocarcinoma

表2 肺腺癌患者临床特征与TRPM8表达的关系Table 2.The correlation between the TRPM8 protein expression and the clinicopathological characteristics of patients with lung adenocarcinoma

5 过表达TRPM8对A549细胞周期及凋亡的影响

流式细胞术结果显示，相对于空载体组，过表达TRPM8的A549细胞S期比例显著升高（P＜0.01），见图3A；而过表达TRPM8的A549细胞与感染空载体的对照细胞的早期及晚期凋亡率差异无统计学显著性（P＞0.05），见图3B。

6 过表达TRPM8对A549细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示，过表达TRPM8的A549细胞迁移率在划痕后8 h差异无统计学显著性（P＞0.05），在划痕后16和24 h显著降低（P＜0.05），而亲本和空载体A549细胞在不同时点迁移率的差异均无统计学意义（P＞0.05），见图4。

表3 Cox回归模型单因素和多因素分析肺腺癌患者不良预后的危险因素Table 3.The risk factors for poor prognosis of lung adenocarcinoma patients evaluated by univariate and multivariate Cox regression analysis

7 过表达TRPM8对A549细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验结果显示，在相同时间内过表达TRPM8的A549细胞侵袭数（121.17±10.97）比亲本及空载体A549细胞（618.17±67.52和529.83±45.50）显著减少（P＜0.01），见图5。

8 过表达TRPM8对免疫缺陷小鼠H1299细胞移植瘤的影响

通过慢病毒感染上调H1299细胞中TRPM8的表达，Western blot结果显示TRPM8在H1299细胞表达显著上调，见图6A。将H1299细胞接种于C57/BL6N免疫缺陷小鼠，构建移植瘤模型，移植瘤生长曲线显示，TRPM8过表达的H1299细胞移植瘤生长速率显著低于空载体对照的H1299细胞移植瘤（P＜0.01），见图6B、C。处死免疫缺陷小鼠后称量移植瘤重量，结果显示，TRPM8过表达的H1299细胞移植瘤重量较对照组显著降低（P＜0.01），见图6B、D。

讨 论

我们的研究结果首次在肺腺癌患者肿瘤组织中证实TRPM8蛋白的表达，生存分析结果显示肺腺癌中高表达TRPM8的患者4～5年累积生存率显著高于TRPM8低表达的患者，单因素和多因素Cox回归分析都显示TRPM8低表达与肿瘤患者不良预后有关，而且TRPM8高表达者肿瘤直径更小，T分期更小，无远处转移的患者TRPM8高表达居多。因从，临床资料提示肺腺癌高表达TRPM8似乎是一个保护因素，这与其他肿瘤中TRPM8的作用是不一致的。

TRPM8参与了前列腺上皮细胞增殖和（或）凋亡的调控，而其表达受雄激素受体调控［13］，在雄激素敏感性LNCaP细胞中高表达的TRPM8促进了细胞的增殖，阻断TRPM8功能或降低TRPM8表达都能诱导LNCaP细胞凋亡。Liu等［14］发现乳腺癌细胞TRPM8过表达促进癌细胞迁移，沉默TRPM8基因抑制高侵袭性乳腺癌细胞的侵袭和转移能力。Wang等［15］发现，人骨肉瘤中TRPM8表达增加，并与骨肉瘤细胞的增殖和移动有关。这些研究显示TRPM8促进了肿瘤的增长、侵袭和转移。我们研究显示TRPM8在肺腺癌患者肿瘤组织表达，高表达者预后好，提示其作为抑癌基因起作用，与其在前列腺癌，乳腺癌及骨肉瘤中的研究不同，具体机制不清楚。研究发现，早期前列腺癌为雄激素依赖性，TRPM8表达增加，随着癌转化为雄激素非依赖性，TRPM8表达降低，前列腺癌恶化进展、转移，预后变差［16］。在雄激素非依赖的前列腺癌细胞PC-3中上调TRPM8的表达可显著抑制肿瘤细胞的增殖及迁移能力，诱导细胞G0/G1期阻滞，抑制与肿瘤黏附能力相关的酶［17］。这提示TRPM8在不同肿瘤组织的作用不同，在前列腺癌中可能与激素存在与否相关。但在肺腺癌中，研究发现雄激素受体在不同性别之间表达无显著差异，且雄激素受体的表达高低与患者的预后无显著相关性［18］，因而TRPM8的表达是否受到雄激素的调控目前还不清楚，需要进一步研究。

Figure 2.The effects of TRPM8 protein on the proliferation of A549 cells.The A549 cells were infected with lentivirus containing mock vector or TRPM8 cDNA vector.A：the TRPM8 mRNA expression was detected by RT-PCR；B：the TRPM8 protein expression was detected by Western blot；C：CCK-8 assay showed that overexpression of TRPM8 in A549 cells inhibited the viability of the cells；D：colony formation assay showed that overexpression of TRPM8 in A549 cells inhibited the colony-forming ability of the cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.01 vs A549 group or A549 empty control group.图2 CCK-8法及集落形成实验检测TRPM8蛋白对A549细胞增殖能力的影响

为了进一步探讨TRPM8在肺腺癌中的作用，我们选取肺腺癌A549细胞株，采用含重组人TRPM8基因慢病毒颗粒感染A549细胞，上调TRPM8表达。CCK-8法及集落形成实验结果证实，过表达TRPM8后，A549细胞增殖能力下降。流式细胞术分析过表达TRPM8后，A549细胞S期比例显著升高，凋亡无显著变化，提示过表达TRPM8导致增殖能力下降可能是诱导肿瘤细胞S期阻滞所致，而非通过影响凋亡途径。划痕实验结果显示，过表达TRPM8后，A549细胞移动能力下降。Transwell侵袭实验结果显示，过表达TRPM8后，A549细胞侵袭能力下降。而在胰腺导管癌细胞中，沉默TRPM8表达可增强肿瘤的迁移能力，激活TRPM8则抑制其迁移能力［19］，与我们的研究结果一致，提示TRPM8抑制肺腺癌细胞的侵袭和迁移能力。为了观察上调TRPM8对肺腺癌细胞生物学行为的整体影响，我们采用免疫缺陷小鼠移植瘤实验，观察TRPM8对肿瘤生长的影响。结果显示，过表达TRPM8后，H1299细胞所形成肿瘤的生长速率较对照组显著下降，肿瘤重量较对照组显著降低。与Zhu等［20］在PC-3前列腺癌细胞中过表达TRPM8抑制裸鼠移植瘤的实验结果一致。这些研究结合我们的实验结果表明，过表达TRPM8会影响了肺腺癌的增殖、侵袭和转移等生物学行为。

Figure 3.The effects of overexpression of TRPM8 protein on the cell cycle and apoptosis in A549 cells.A：flow cytometry analysis for cell cycle of A549 cells；B：the apoptosis of A549 cells was detected by flow cytometry with annexin V and PI staining，and the early and late apoptotic rates were calculated.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs A549-empty control group.图3 上调A549细胞中TRPM8的表达对细胞周期及凋亡的影响

Figure 4.The effects of TRPM8 on the migration ability of A549 cells detected by cell scratch test.Mean±SD.n=3.*P＜0.01 vs A549-empty control group.图4 细胞划痕实验检测上调A549细胞中TRPM8表达对细胞迁移能力的影响

Figure 5.The effects of TRPM8 on the invasiveness of A549 cells.Scale bar=50 µm.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs A549-empty control group.图5 TRPM8对各组A549细胞侵袭能力的影响

Figure 6.The effects of TRPM8 on the growth and weight of H1299 cell-derived xenograft tumor in C57/BL6N immunodeficient mice.A：Western blot analysis showed that TRPM8 was stably up-regulated in H1299 cells；B：H1299 cell-derived xenograft tumors in C57/BL6N immunodeficient mice and the isolated tumors；C：the tumor growth curves；D：the tumor weight.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs H1299-control group.图6 TRPM8对C57/BL6N免疫缺陷鼠移植瘤生长的影响

但肺腺癌TRPM8表达的变化及调控肿瘤细胞生物学行为的具体机制尚不清楚。前列腺癌TRPM8的表达受雄激素受体调控［13］。随着癌转化为雄激素非依赖性，TRPM8表达降低［16］。TRPM8在乳腺癌中的表达和功能受雌激素受体α调控［21］。似乎性激素参与了TRPM8的表达和功能，但我们的结果显示肺腺癌患者TRPM8表达与性别无关，亚组生存分析也显示在男性和女性患者中，高表达TRPM8预后均优于低表达TRPM8的肺腺癌患者，二者之间无显著差异（资料未提供）。Asuthkar等［22］研究显示，TRPM8启动子上存在P53结合位点，过表达P53增加TRPM8的表达，TRPM8可能是P53的下游基因。而作为阳离子通道的TRPM8，激活会引起Ca2+内流，Ca2+作为第二信使调控细胞增殖、运动、凋亡等细胞生物学行为，可能是其作用机制。

总之，本研究在人肺腺癌组织探讨TRPM8表达的意义：TRPM8高表达的患者4～5年累积生存率显著高于TRPM8低表达的患者，TRPM8低表达是影响患者预后的独立危险因素。在肺腺癌A549细胞过表达TRPM8抑制了其增殖、迁移和侵袭能力；上调肺腺癌H1299细胞中TRPM8蛋白表达抑制其移植瘤的生长。但肺腺癌中TRPM8的作用机制仍需要进一步研究。