NLRP3炎症小体在小鼠甲型流感病毒感染继发MRSA肺炎中的表达变化*

石云锋， 师小函， 朱 军， 罗进梅， 巴俊慧， 陈健宁， 吴本权△

（1中山大学附属第三医院MICU，呼吸与危重症医学科，广东广州510630；2浙江大学医学院附属第四医院呼吸与危重症医学科，浙江义乌322000；3中山大学附属第三医院病理科，广东广州510630）

甲型流感病毒（甲流病毒）引起的流感传播范围广、肺炎发病率高，给人类健康及公共卫生带来极大的威胁与负担。甲流病毒感染1周时易继发细菌性肺炎，其中继发耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）肺炎是最常见并最严重的并发症，死亡率高达60%［1-2］。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体是肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages，AMs）抗甲流病毒免疫的主要机制，并在抗MRSA免疫中起作用［3］。由于MRSA对抗菌药物的广泛耐药性，积极研究甲流病毒感染继发MRSA肺炎的免疫治疗有重要临床意义。对甲流病毒感染继发细菌性肺炎的研究多数关注的是金黄色葡萄球菌，对其机制的研究则集中于细菌黏附性增加、局部免疫屏障损害、免疫细胞吞噬能力及数量下降等［4-8］。Robinson等［9］研究发现甲流病毒感染通过抑制白细胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）的产生加剧了继发性金黄色葡萄球菌肺炎。但NLRP3炎症小体在甲流病毒感染继发MRSA肺炎中的表达如何变化，国内外未见进一步研究。本研究以MRSA滴鼻感染经甲流病毒H1N1预感染6 d的小鼠建立甲流病毒感染继发MRSA肺炎模型，研究NLRP3炎症小体在其中的表达变化。

材料和方法

1 实验用病毒、细菌及动物

甲流病毒H1N1/FM1株（H1N1）为鼠肺适应株，获赠于暨南大学医学院微生物学与免疫学教研室，前期研究及他人已发表研究证实了该病毒株引起小鼠病毒性肺炎的致病力［10-11］。MRSA菌株为中山大学附属第三医院呼吸与危重症医学科实验室分离鉴定的临床菌株。C57BL/6雄性小鼠15只，鼠龄30～35 d，购于广东省实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）2013-0002。实验方案遵循《赫尔辛基宣言》原则及动物伦理要求。

2 主要试剂

MLV第1链合成试剂盒与SYBR®select master mix购于 Life Technologies；RT-qPCR引物由 Life Technologies设计并合成；兔抗NLRP3单克隆抗体购于Cell Signaling Technology；兔抗caspase-1单克隆抗体购于Novus Biologicals；兔抗GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ⅱ抗和全蛋白提取试剂盒及蛋白浓度检测试剂盒购于广州杰特伟科技有限公司；IL-1β ELISA检测试剂盒购于R&D。

3 主要方法

3.1 甲流病毒H1N1复苏及毒力的测定 复苏液氮罐中冻存的甲流病毒H1N1/FM1株，于9日龄鸡胚尿囊腔连续传代2次扩增后，以鸡红细胞血凝试验测定扩增的病毒效价为1∶640。确定半数致死量（median lethal dose，LD50）为 2-2.83/50 µL［10］。

3.2 细菌培养及菌落形成单位的测定 解冻-80℃冻存的MRSA菌株，接种于血琼脂培养基并于37℃温箱中培养24 h。挑取长势良好的菌落溶于无菌PBS中，测定其在600 nm处吸光度A值。A600=0.6时，MRSA菌落浓度为1×1012CFU/L。预实验确定MRSA的LD50为该浓度之菌液50µL。

3.3 小鼠分组、肺炎模型建立及标本取材 小鼠在SPF级环境下饲养1周后开始实验，随机分成空白对照（control）组、MRSA组和H1N1+MRSA组，每组5只。实验开始时（d0），空白对照组及MRSA组每只小鼠以50µL PBS液滴鼻，H1N1+MRSA组每只小鼠以50µL LD50浓度的甲流病毒H1N1滴鼻。6 d后（d6），空白对照组每只小鼠以50µL PBS液滴鼻，MRSA组及H1N1+MRSA组每只小鼠以50µLA600=0.6的MRSA菌液滴鼻。24 h后，眼眶取血并以颈椎脱臼法处死小鼠摘取肺脏。滴鼻操作在腹腔注射水合氯醛（10%，80µL）麻醉小鼠后执行。眼眶取血以及颈椎脱臼法处死小鼠在腹腔注射水合氯醛（10%，80µL）联合肌肉注射盐酸氯胺酮（30 mg/kg）麻醉并镇痛后执行。分离血清，-80℃保存，用于IL-1β浓度检测。左肺上叶及下叶置于液氮中保存，分别用于提取蛋白和RNA。右肺以多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，HE染色，光镜下观察肺组织病理。实验过程中观察并记录小鼠的生存率、一般情况和体重变化等。体重变化率（%）＝（实验结束时体重-实验开始时体重）/实验开始时体重×100%，MRSA感染24 h体重下降率（%）＝（MRSA感染24 h体重-MRSA滴鼻感染时体重）/MRSA滴鼻感染时体重×100%。

3.4 RT-qPCR检测小鼠肺组织NLRP3、caspase-1和IL-1β的mRNA水平 研磨小鼠左肺下叶制成悬液，以Trizol法提取组织总RNA，检测RNA浓度及A260/A280值。应用ABI7500系统行实时荧光定量PCR检测。反应条件为：50℃ 2 min，95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃30 s，60℃15 s。以β-actin为内参照。检查RT-qPCR的扩增曲线及熔解曲线，记录目的基因与内参基因的Ct值。ΔCt=Ct目的基因-Ct内参照基因，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt空白对照组，以2-ΔΔCt法计算各实验组目的基因mRNA的相对表达量。每个标本RT-qPCR重复3次并取均值。NLRP3、caspase-1和IL-1β的RT-qPCR反应引物见表1。

表1 NLRP3、caspase-1和IL-1β的RT-qPCR引物序列Table 1.Primer sequences of NLRP3，caspase-1 and IL-1β for RT-qPCR

3.5 Western blot检测小鼠肺组织NLRP3和caspase-1蛋白的表达水平 裂解小鼠左肺上叶后，提取总蛋白，以BCA蛋白含量检测试剂盒测定蛋白浓度。Western blot实验按每孔30µg蛋白上样，行SDSPAGE分离，转至PVDF膜上，含5%牛血清白蛋白室温封闭1 h，予相应的Ⅰ抗4℃孵育过夜，Ⅱ抗室温孵育1 h，加入ECL发光液，在Chemi Scope化学发光成像系统显影。以GAPDH为内参照。用ImageJ软件分析目的蛋白与内参照蛋白的灰度值，以目的蛋白灰度值与GAPDH灰度值的比值作为各目的蛋白的相对表达量。

3.6 ELISA检测小鼠血清IL-1β的浓度 根据ELISA检测试剂盒的操作流程，设复孔数为3，取450 nm处吸光度测量值的平均值。制作标准曲线，依据标准曲线计算各组小鼠血清IL-1β的浓度。

4 统计学处理

采用SPSS Statistics 20.0软件统计分析。数据均符合正态分布，以均数±标准差（mean±SD）表示。两组间比较选择t检验。多组比较选用单因素方差分析，各组均数间的两两比较采用Bonferroni校正的t检验。体重下降率与血清IL-1β浓度相关性分析选择Pearson积矩相关系数分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 小鼠肺组织NLRP3和caspase-1的mRNA及蛋白相对表达量

NLRP3和caspase-1的mRNA表达水平在MRSA组和空白对照组未见明显差异（P＞0.05），而在H1N1+MRSA组表达明显升高，与空白对照组和MRSA组比较差异均有统计学意义（P＜0.01），见图1。NLRP3和caspase-1的蛋白表达水平在MRSA组与空白对照组未见统计学差异（P＞0.05），而在H1N1+MRSA组表达明显升高，与空白对照组和MRSA组比较差异均有统计学意义（P＜0.01），见图2。NLRP3及caspase-1的蛋白表达变化与其mRNA变化趋势相一致。

2 小鼠肺组织IL-1β的mRNA相对表达量及血清IL-1β浓度的比较

IL-1β的mRNA表达水平在MRSA组及H1N1+MRSA组均明显高于空白对照组，但在H1N1+MRSA组的水平却低于MRSA组，两两比较的差异均有统计学意义（P＜0.01）。血清IL-1β浓度在MRSA组及H1N1+MRSA组均明显高于空白对照组，但在H1N1+MRSA组的浓度却低于MRSA组，两两比较的差异均有统计学意义（P＜0.01）。IL-1β的血清浓度变化与其mRNA变化趋势相一致，见图3。

Figure 1. Relative mRNA levels of NLRP3 and caspase-1 in the lung tissues of mice were assessed by RT-qPCR.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs MRSA group.图1 小鼠肺组织NLRP3和caspase-1的mRNA相对表达量比较

3 小鼠肺组织的病理观察结果

空白对照组小鼠肺组织病理示正常肺组织结构：支气管壁、血管及肺泡完整，肺泡内及组织间隙无明显的肿胀及炎症细胞浸润。MRSA组小鼠肺组织见弥漫性支气管炎和肺炎，肺泡间隔增厚，见较多的炎症细胞浸润及充血。H1N1+MRSA组小鼠肺组织病理可见更严重的炎症损害，肺泡结构破坏，肺泡间隔增厚，大量炎症细胞浸润，局部支气管阻塞及肺泡实变，血管充血甚至出血，见图4。

Figure 2.Relative protein levels of NLRP3 and caspase-1 in the lung tissues of mice were measured by Western blot.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs MRSA group.图2 小鼠肺组织NLRP3与caspase-1蛋白相对表达量的比较

Figure 3.Relative mRNA level of IL-1β in the lung tissues and the serum concentration of IL-1β in the mice.A：the mRNA level of IL-1β in the lung of mice；B：the serum concentration of IL-1β in the mice.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs MRSA group.图3 小鼠肺组织IL-1β的mRNA相对表达量和血清IL-1β浓度的比较

Figure 4.The pathological changes of the lung in mice（HE staining，scale bar=100µm）.图4 小鼠肺组织病理改变

4 小鼠体重变化情况以及与血清IL-1β的相关性

各组小鼠在实验过程中均全部存活，以体重变化率作为评估病情严重程度及预后的指标。空白对照组小鼠进食、活动如常，实验结束时体重平均增加（12.16±2.78）%。MRSA组小鼠在MRSA感染前进食、活动如常，在MRSA感染后出现摄食量下降、活动减少，感染 24 h体重平均下降（5.61±1.47）%。H1N1+MRSA组小鼠在甲流病毒感染后毛色无光泽、摄食量下降、活动减少，在MRSA继发感染后摄食量下降及活动减少明显加重，实验过程体重平均下降（26.29±2.22）%。H1N1+MRSA组小鼠在MRSA继发感染24 h后体重平均下降（9.00±5.45）%，高于MRSA组的感染24 h后的体重下降率，但差异没有统计学显著性（P＞0.05）。MRSA组与H1N1+MRSA组小鼠总体重下降率均与血清IL-1β呈负相关（r分别为-0.951与-0.953，P ＜0.05），见图5。

Figure 5.Scatter plots of correlation between the rate of weight loss and the serum concentration of IL-1β.n=5.图5 小鼠体重下降率与血清IL-1β浓度相关性的散点图

讨 论

甲流病毒和MRSA均是常见的致病菌，可分别感染或联合感染机体引起支气管炎和肺炎等呼吸系统疾病。临床观察发现，甲流病毒感染1周时易继发金黄色葡萄球菌肺炎，其中继发MRSA肺炎的病例死亡率可高达60%，是甲流病毒感染导致临床死亡的主要原因［1，12-13］。预防或早期阻断继发性MRSA肺炎对减轻甲流病毒感染的病情及降低病死率有重要意义。

模式识别受体中的Toll样受体（Toll like recep-tor，TLRs）、NOD样受体（NOD like receptor，NLRs）独立或相互协同地介导抗甲流病毒及抗MRSA免疫作用。NLRP3炎症小体是由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白与半胱天冬酶1组成的三聚体，在感染及非感染引起的炎症反应中均起重要作用［14-15］。NLRP3炎症小体在抗感染免疫中通过两种信号通路起作用。信号通路1为TLR-NF-κB信号途径，转录、翻译生成NLRP3、caspase-1以及白细胞介素1β前体（pro-IL-1β）。信号通路2为NLRP3炎症小体三聚体形成并生成cleaved-caspase-1，后者剪切pro-IL-1β为IL-1β。IL-1β介导下游的炎症反应及病原体清除，在抗感染免疫中起重要保护作用［16］。

国内外关于NLRP3炎症小体与MRSA感染关系的研究较少。Muller等［17］研究发现从MRSA提纯的肽聚糖可激活NLRP3炎症小体。本研究发现MRSA感染引起IL-1β的mRNA表达及血清浓度升高，组织病理见到肺炎改变，小鼠体重下降。已知IL-1β是促进炎症反应的重要细胞因子，我们推断IL-1β参与了MRSA肺炎的致病机制。但MRSA组NLRP3、caspase-1的mRNA及其蛋白表达量均没有增加，表明MRSA感染引起的IL-1β的转录及分泌并不依赖NLRP3炎症小体途径。已有研究证实IL-1β的产生除了经典的TLR-NF-κB-NLRP3炎症小体信号途径，其他一些丝氨酸蛋白酶信号途径也能激活产生IL-1β［18-19］。Kremserova等［20］研究发现 MRSA 感染中性粒细胞引起的IL-1β释放经由RIPK3途径，不依赖NLRP3及caspase-1的活化。Richa等［21］发现金黄色葡萄球菌感染中枢神经系统由凋亡相关斑点样蛋白而不是由NLRP3介导炎症反应及保护作用。上述研究支持并部分解释了本研究结果，但IL-1β在MRSA肺炎中的作用及机制还需要进一步的研究。

早期大量研究证实甲流病毒感染可激活NLRP3炎症小体并引起IL-1β的产生和分泌［3］。甲流病毒预感染继发MRSA肺炎小鼠NLRP3和caspase-1的表达比空白对照组升高考虑是由甲流病毒感染引起的。进一步分析实验结果，H1N1+MRSA组与MRSA组相比，虽然NLRP3和caspase-1的mRNA及其蛋白表达量均增强，但IL-1β的mRNA表达及血清浓度均降低。该结果表明甲流病毒预感染虽然激活了NLRP3与caspase-1，但总体上降低了MRSA感染引起的IL-1β的表达，提示甲流病毒预感染抑制了机体抗MRSA感染免疫的IL-1β的上游信号通路。如可能的机制为甲流病毒预感染激活NLRP3炎症小体信号通路1的TLR17，竞争性抑制了巨噬细胞抗MRSA免疫的TLR2和TLR4信号通路，总体上降低了巨噬细胞对MRSA的免疫反应。针对NLRP3、caspase-1与IL-1β在甲流病毒预感染后联合感染金黄色葡萄球菌中表达分离的现象，Robinson等［9］研究NLRP3炎症小体上游信号途径发现，其是由甲流病毒预感染抑制了NF-κB并引起pro-IL-1β的产生降低引起的，该结果与本实验结果相符。

IL-1β是病原体清除所必要的炎症细胞因子，在甲流病毒感染继发MRSA肺炎的抗感染中起保护作用［9，22］。Shirey等［23］研究发现甲流病毒感染1周可抑制机体产生干扰素β及其下游的炎症细胞因子，从而抑制机体的免疫状态并导致继发性细菌感染。与之相似的，本研究发现H1N1+MRSA组小鼠血清IL-1β浓度较MRSA组低，但肺组织病理的炎症反应更加严重，联合感染时间内体重下降更明显。分析H1N1+MRSA组及MRSA组体重下降率与IL-1β血清浓度相关性发现，体重下降率与IL-1β血清浓度成负相关。在H1N1+MRSA组小鼠在MRSA感染24 h的体重平均下降率与MRSA组小鼠的体重平均下降率比较中，前者高于后者，但差异没有统计学意义，考虑是由H1N1+MRSA组数据离散（标准差大）引起的，判断增加小鼠的样本量将发现统计学差异，两组间体重下降率仍反映肺炎严重程度的差异。归纳上述分析，甲流病毒预感染抑制了机体抗MRSA感染的IL-1β的表达及分泌，导致了严重的MRSA肺炎及不良预后，该效应可能是继发于甲流病毒感染的MRSA肺炎更为严重的机制之一。

综上所述，本研究关注甲流病毒感染继发MRSA肺炎，发现MRSA感染引起IL-1β的产生和释放不依赖NLRP3炎症小体途径，而甲流病毒预感染虽然上调NLRP3炎症小体的表达，但总体降低了机体抗MRSA免疫的IL-1β的表达及分泌，该效应可能是甲流病毒感染易继发MRSA肺炎并引起重症感染的机制之一。本研究为以NLRP3炎症小体作为靶点防治甲流病毒感染继发MRSA肺炎的免疫治疗增加了理论依据。