2018年山东省蛋鸡H9N2亚型禽流感病毒流行情况调查

李 悦，张会霞，张 慧，姜胜男，宋一诺，刘思当

(山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安，271018)

禽流感(avian influenza,AI )是由A型流感病毒(AIV)引起的一种见于世界范围的禽类疫病。流感病毒(influenza virus,IV)，属正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，系RNA病毒。基于血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)表面抗原，可将病毒分为不同的亚型，现已知HA有18个亚型，NA有11个亚型[1]。IV在呼吸道黏膜上皮细胞内复制引起上皮细胞损伤及黏膜的炎症反应，表现为急性上呼吸道炎症和发热症状[2]。

1994年，陈伯伦等[3]首次在广东某鸡场分离到H9N2亚型AIV，随后发现在国内广泛性流行，对我国家禽养殖业造成严重的影响。预防本病的主要措施是使用具有良好免疫保护效果的灭活疫苗。为了解山东省H9N2亚型AI疫苗的免疫效果，2018年本课题组在山东省部分地区的蛋鸡场收集105份发病鸡组织样品和2 424份血液样品，通过RT-PCR方法和血凝抑制试验进行病毒和抗体水平检测，分离纯化AIV并对HA基因扩增测序，进行遗传进化分析，以此评估山东省蛋鸡群H9N2亚型 AI免疫水平及疫情流行状态，为蛋鸡场AI的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料AI标准抗原、阳性血清购自哈尔滨维科生物技术开发公司；主要试验材料有磷酸盐缓冲液、3.8%柠檬酸钠、1%鸡红细胞悬液、96孔V型反应板和微量移液枪；SPF鸡胚购自山东省农业科学院家禽研究所。

1.2 样品采集及处理在山东省部分地区(聊城、泰安、济南、淄博、东营、菏泽、济宁、德州、临沂、潍坊)规模化蛋鸡场收集有呼吸道症状和产蛋下降的临床病例105份，剖检病鸡观察眼观病变，取气管、肺脏、卵泡和输卵管组织，于10%福尔马林溶液固定，取气管及肺组织，进行RT-PCR检测；对上述地区的蛋鸡场采集血液2 424份，静置1～2 h使血液凝固，待析出血清后，吸取血清放置—20℃冰箱待检。

1.3 切片的制作将固定好的组织梯度酒精脱水、透明、石蜡包埋、切片和HE染色。

1.4 血凝及血凝抑制试验按照国家标准(GB/T18936-2003)采用血凝(HA试验)和血凝抑制试验(HI试验)对血清样品进行抗体检测[4]。

1.5 RNA提取将收取的阳性病料用PBS双抗(青、链霉素浓度各为10 000 U/mL)研磨处理后接种9～11日龄SPF鸡胚，37℃培养72 h(弃掉24 h 内死亡鸡胚)，4℃过夜，无菌收取尿囊液，用Trizol法提取总RNA，-80℃留存备用。

1.6 RT-PCR反应按照One Step RT-PCR试剂盒体系进行PCR扩增(表1)，将M引物做流感通用引物，HA基因分为2段扩增。50℃ 30 min反转录；94℃ 5 min 预变性；94℃ 45 s 变性；退火 53℃ 45 s；72延伸1.5 min；共35 个循环；最后 72℃延伸 10 min， 4℃结束反应，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳验证。

1.7 结果判定收取HA效价≥4的SPF鸡胚尿囊液于-80℃保存，用血清学和RT-PCR方法验证病毒为H9N2 AIV；血清用血凝及血凝抑制法测定抗体滴度，将96孔V型反应板倾斜45°，观察并记录血凝抑制效，HI≥4为合格。

2 结果

2.1 剖检病变H9N2亚型AIV感染可造成蛋鸡肿眼流泪、鸡冠发紫和蛋壳质量下降等外观病症，剖检病鸡多见气管黏膜附有较多黏液，黏膜充血肿胀，有的发生支气管栓塞，肺暗红色肿胀，卵黄膜充血出血，有的病鸡卵泡破裂引起卵黄性腹膜炎，输卵管黏膜肿胀附有渗出的黏液。病鸡多见纤维素性心包炎、气囊炎及肝包炎等继发感染病变(图1)。

表1 引物扩增序列

图1 病鸡剖检病变 A．卵黄充血、坏死液化，输卵管卡他性炎症；B.支气管内有黄色栓塞物；C.纤维素性肝包炎及心包炎

2.2 病理组织学患病鸡病理组织学病变主要表现为，气管黏膜层充血出血、淋巴细胞浸润，肺组织充血，多伴有间质性肺炎及纤维素性炎症；卵泡膜充血出血，常见卵黄破裂引起的卵黄性腹膜炎，输卵管黏膜充血肿胀呈卡他性炎症(图2)。

图2 病鸡病理组织学病变 A.肺脏充血出血，三级支气管内有红染的纤维素性渗出物，HE 100×；B.卵黄膜充血，出血，HE 200×；C.气管黏膜充血出血，水肿，淋巴细胞浸润，HE 400×

2.3 病原检测结果将105份疑似病例进行实验室检测，经RT-PCR鉴定有18份IV阳性，且全部为H9N2亚型AIV，检出率为17.14%，统计可得，春季的检出率最高，为35.48%，其次为冬季，检出率为17.14%，夏季检出率为0，说明AI在春、冬季节多发，夏、秋季节少见。在18份流感阳性样品中，有2份与新城疫病毒共感染，2份与传染性支气管炎病毒共感染，共感染率为22.22%(图3)。

2.4 抗体检测结果按月份统计H9N2亚型AI抗体滴度,将全年血清样品的抗体检测结果按照不同月份进行统计(表2,3)，发现2018年12个月份的H9N2亚型AI抗体平均水平较高，全样品抗体合格率(HI≥4)为98.68%。其中2月份平均抗体滴度最高，达到11.26log2，离散度最低，为11.21%。6月份平均抗体滴度最低，为7.13log2，离散度最高，为46.28%。优秀率最高的月份是2月份，达到91.35%，最低的是6月份，为33.33%，这与养殖场在秋冬季节加强疫苗免疫有关。

图3 H9N2亚型AIV检出率月份分布

表2 2018年不同月份H9N2亚型AI抗体滴度统计

表3 2018年不同月份H9N2亚型AI抗体离散度

2.5 HA基因遗传进化分析遗传进化分析结果显示，10株H9N2亚型AIV均属于欧亚谱系Y280-like分支(h9.4.2亚系)，与G57基因型病毒处于同一进化分支。HA蛋白关键氨基酸位点分析表明，两分离株(A/Chicken/Shandong/FX502/2018和A/Chicken/Shandong/FX806/2018)HA裂解位点为HSRSSR/GLF，其他8个分离株为PSRSSR/GLF，均符合低致病性AIV分子特征。HA受体结合位点如表4所示，除198位存在突变外，其他各位点相对保守。右侧壁第149位存在多样性，A/Chicken/Shandong/348/2018和A/Chicken/Shandong/370/2018为K，A/Chicken/Shandong/FX428/2018为I，其他7个分离株为T。研究发现K149I突变位点可显著改变鸡抗血清滴度，可能会降低病毒与抗体的结合，换言之，此位点突变可以通过增加HA受体结合亲和力来克服与抗体结合[5](图4)。

3 讨论

近年来，H9N2亚型AI在我国广为流行，虽然发病鸡群症状表现轻微或无明显症状，但该病具有潜伏期长的特点，常与大肠杆菌、新城疫等疾病发生并发或继发感染，使症状加重，病情复杂，给发病鸡群带来严重的经济损失，严重威胁我国蛋鸡业的健康发展。该病毒鸡、鸭、鹅均易感且长期存在家禽体内，可能会有助于病毒的跨物种传播，增加病毒基因重组的几率，促进出现新型病毒的可能[6]。该病对人具有潜在感染的可能，对人类健康存在潜在威胁[3],H9N2亚型AIV流行病学的细致研究对公共卫生以及家禽业的健康养殖均具有重要意义[7]。

表4 HA基因受体结合位点

图4 H9N2亚型AI分离毒株 HA 基因进化树 注：●.本试验分离株；▲.参考毒株

本研究对2018年山东省10个地区(聊城、泰安、济南、淄博、东营、菏泽、济宁、德州、临沂、潍坊)的蛋鸡养殖场采集疑似临床病例，通过剖检和镜检病变观察，发现H9N2亚型AIV主要侵害病鸡的呼吸系统和生殖系统。病鸡有严重的呼吸道症状，同时产蛋下降，破壳蛋、软壳蛋比例增加，对蛋鸡养殖业造成极大损失。AIV HA通过识别细胞表面唾液酸SAα-2,3Gal受体进入宿主细胞，王晶钰等[8-9]证明鸡的呼吸道、消化道和输卵管存在大量SAα-2,3Gal受体，这说明AIV可以直接感染鸡的呼吸道和输卵管黏膜上皮细胞，这是造成病鸡临床症状的直接原因。

疫苗免疫是我国防控AIV的重要手段，研究表明，灭活疫苗的使用可能会加快病毒变异速率[10]。本研究对105份病料和2 424份血清样品分别进行病原和抗体检测，通过对检测结果统计分析发现，2018年H9N2亚型AI呈散发性流行，在春、冬季节多发，抽查的蛋鸡群各月份的抗体滴度均保持较高水平。对病原检测结果和抗体检测结果关联分析发现，春季病原检出率最高，抗体滴度平均值处于8.88log2的较高水平，离散度明显高于其他季节。此外，在抗体平均滴度最低的6月份，也已达到7.13log2，这时鸡群已处于较高的免疫状态，这说明山东省内的蛋鸡养殖场对H9N2亚型AI有较强的防疫意识，免疫强度较大并取得了良好的免疫效果。值得注意的是，在高抗体免疫鸡群中存在感染发病现象，这可能与流感病毒的变异有关，当然也与其他诱发因素的影响密切相关，因此我国AI的免疫防控工作仍面临巨大挑战。

H9N2亚型AIV分为欧亚和北美两大分支，欧亚分支又可分为Y439-like、Y280-like、G1-like和KR323-like。为了便于在病毒进化、生态学及流行病学方面的沟通，刘硕等[11]提出一种新的命名方法，可以将H9亚型AIV分为4个谱系，命名为h9.1～h9.4。系统进化分析表明，本研究10株H9N2亚型AIVs属于Y280-like(h9.4.2)，说明山东省规模化蛋鸡场流行的H9N2亚型AIVs属于Y280-like分支，与其他报道一致[12]。分离株与国内疫苗株A/Chicken/Shanghai/F/98的遗传距离较远，表明现流行的AIVs已发生遗传变异，现有疫苗不能很好的保护免疫鸡群，提示应及时更换疫苗株。HA基因某些关键性氨基酸位点单突变会影响流感病毒的抗原性和发病机制，本研究分离株A/Chicken/Shandong/348/2018和A/Chicken/Shandong/370/2018的166位点为N，其余8株为D，研究显示N166D位点突变会降低抗体反应，这可能会导致疫苗接种免疫失败[13]，因此应对H9N2亚型AIV持续监测，为AI的疫苗研发及免疫防控提供新的资料。