2个维生素B6中间体的HPLC快速检测

朱秋楠 于荣 王少云 马晓芳(宁夏泰益欣生物科技有限公司，宁夏 银川 750205)

0 引言

维生素B6(Vitamin B6，简称VB6)在自然界中以吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺三种形式存在，在医疗、食品、饲料及化妆品工业上有着广泛的用途[1-2]。近年来，我国在维生素B6生产中采用了先进的草酰唑工艺，降低了生产成本，增强了国际竞争力[3-4]。维生素B6的检测早有报道，但其中间体的检测多用气相色谱，未见高效液相色谱的检测方法[5-7]。本文拟采用高效液相色谱法建立了一种测定维生素B6中间体N-乙氧草酰-L-丙氨酸乙酯(1)和4-甲基-5乙氧基噁唑(2)的快速检测方法，旨在解决维生素B6中间体沸点高、极性强、热稳定性差的化合物不能用气相色谱检测的限制。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器

岛津LC-20AT-PDA高效液相色谱仪(色谱柱：XBridge C18，4.6*250mm，5μm；检测器：荧光检测器)；Sartorius BSA224S 分析天平(万分之一)。

1.1.2 试剂

N-乙氧草酰-L-丙氨酸乙酯标准品(含量≥93%，自制)；4-甲基-5乙氧基噁唑标准品(含量≥96%，自制)；色谱纯乙腈；优级纯高氯酸钠；二次蒸馏水。

1.2 色谱条件

色谱柱为：XBridge C18，4.6*250mm，5μm，柱温为30℃；以高氯酸钠溶液(pH=2.3～2.7)和乙腈(60+40，V1+V2)溶液为流动相，流动相的流速为0.5mL/min、进样体积为20μL；检测波长为：220nm。

1.3 测定步骤

1.3.1 标准溶液配制

称取定量标准品(精确至0.0001g)置于25mL容量瓶中，加入少许甲醇溶液溶解，用蒸馏水稀释至刻度定容，摇匀、配制成浓度为4.0μg/mL的标样，经0.45μm微孔过滤膜过滤后按照上述色谱条件测定。

1.3.2 样品溶液配制

称取定量试样(精确至0.0001g)置于25mL容量瓶中，加入少许甲醇溶解样品，用蒸馏水稀释至刻度定容。

2 结果与分析

2.1 色谱图

将标样稀释为2.0μg/mL进行检测，根据信噪比为3和10确定检测限和定量限分别为0.016μg/mL 和0.052μg/mL。N-乙氧草酰-L-丙氨酸乙酯(中间体1)和4-甲基-5乙氧基噁唑(中间体2)的标准品色谱图如图1所示。

图1 标准品中间体1和2的 HPLC色谱图

根据图1结果显示，N-乙氧草酰-L-丙氨酸乙酯(中间体1)的相对保留时间为8.8,4-甲基-5-乙氧基噁唑(中间体2)的相对保留时间为10.0；峰度较强、且未见干扰吸收峰，说明该方法可以用于中间体1和中间体2的检测。

2.2 各物质线性关系

将上述标准溶液分别稀释不同倍数得到N-乙氧草酰-L-丙氨酸乙酯(中间体1)和4-甲基-5-乙氧基噁唑(中间体2)的0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL 和4.0μg/mL 不同质量浓度的标准溶液，按照上述色谱条件，测定相应的响应值，以质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标绘制曲线，结果如表1所示。

表1 线性方程

2.3 精密度测定

分别取中间体1和中间体2的小试样品各10个在上述色谱条件下进行检测，每一个样连续、精确重复测定10次，测定结果如表2所示。

根据表2结果显示，N-乙氧草酰-L-丙氨酸乙酯(中间体1)和4-甲基-5-乙氧基噁唑(中间体2)的标准偏差与变异系数均小于5%；说明该方法用于检测中间体1和中间体2具有较好的重现性。

表2 中间体1和2重现性的测定结果

2.4 准确度测定

分别称取5个N-乙氧草酰-L-丙氨酸乙酯和4-甲基-5乙氧基噁唑样品，在每个样品中加入一定量的标准品，在上述色谱条件下检测，测定结果如表3所示。

表3 中间体1和2准确度的测定结果

根据表3结果显示，N-乙氧草酰-L-丙氨酸乙酯(中间体1)和4-甲基-5-乙氧基噁唑(中间体2)的回收率分别为98.16% ～100.29%、98.92%～100.23%；说明该方法用于检测中间体1和中间体2具有较好的精确度。

3 结语

实验结果表明，本方法可以很好的检测维生素B6中间体1和2，中间体1的质量浓度与峰面积曲线相关系数达到0.9970，标准偏差最大值为0.12，变异系数最大值0.13%，回收率为98.16%～100.29%，中间体2质量浓度与峰面积曲线相关系数达到0.9910，标准偏差最大值为0.61，变异系数最大值0.66%，回收率为98.92%～100.23%，目标峰无拖尾、无分叉、分离度高，适用于维生素B6中间体的检测，且分析准确度好，精密度高，方便可行，为维生素B6的生产过程监控提供了方法。