痰标本基因芯片法检测耐多药肺结核的临床价值

马岩 杨晓军 任振娟 苏云开

结核病依然是严重影响全球公共卫生的传染性疾病之一，根据世界卫生组织[1]报道，2018年中国耐多药/利福平耐药患者约为6.6万例，占全球耐多药/利福平耐药患者的14%，是全球耐多药结核病(MDR-TB)的高负担国家之一。内蒙古自治区是耐多药结核病的高负担地区，涂阳肺结核的耐多药率为16.88%，远高于全国的平均水平(8.32%)；特别是复治肺结核患者的耐多药率高达70.13%，提示本地区耐多药结核病疫情非常严峻[2]。

早期诊断耐药结核病是遏制其传播的重要手段。由于结核分枝杆菌(MTB)生长缓慢，传统的表型药物敏感性试验(简称“药敏试验”)至少需1～3个月才能获得诊断结果[3-5]。迫切需要快速诊断耐药结核病、特别是耐多药结核病的检测技术，以改善公共卫生状况[1,6-7]。分子药敏试验的应用显著缩短了耐药结核病的诊断时间，且具有更好的生物安全性，因此在不同层级实验室得到推广应用。基因芯片法采用一种基于多重PCR和反向杂交的基因芯片耐多药试剂盒[8]。一项研究报告了该试剂盒的性能，与传统表型药敏试验方法相比，对利福平耐药的敏感度和特异度分别为83.7%和98.7%，对异烟肼耐药的敏感度和特异度分别为79.9%和99.6%，检测MDR-TB的敏感度和特异度分别为74.1%和99.8%[9]；提示基因芯片法检测MDR-TB的性能良好。本研究的目的是评价内蒙古自治区第四医院结核病实验室利用基因芯片法检测肺结核患者痰标本诊断MDR-TB的性能，以评估基因芯片法检测在诊断MDR-TB方面的临床应用价值。

资料和方法

一、研究设计

2019年6月1日至12月31日连续纳入内蒙古自治区第四医院收治的所有涂阳肺结核患者，每例患者提供2～3份痰标本，每份标本≥2 ml。本院结核病参比实验室选取同一份痰标本同时进行传统表型药敏试验(罗氏比例法药敏试验)和分子药敏试验(基因芯片法)检测。本研究经过内蒙古自治区第四医院伦理委员会的批准(批准号：20200002)。

二、患者纳入

本研究连续纳入295例涂阳肺结核患者，包括住院和门诊患者。患者入组标准：(1)实验室痰涂片检测阳性的患者；(2)年龄≥18岁；(3)患者签署知情同意书。

所有进行罗氏比例法药敏试验的标本中， 25份培养阴性(8.5%，25/295)和8份培养污染(2.7%，8/295)，在进行罗氏比例法药敏试验和经MPB64进行菌种鉴定时，有10份(3.4%，10/295)菌种鉴定结果为非结核分枝杆菌，另有13份(4.4%，13/295)标本罗氏比例法药敏试验结果检测失败，而具有药敏试验结果的239例患者中，4例患者痰标本基因芯片检测结果中未检测到结核分枝杆菌，因此最后用于罗氏比例法药敏试验结果分析的患者为235例。

痰标本所含结核分枝杆菌的阳性级别会影响基因芯片的检测结果[10]。本研究基因芯片法检测痰标本结果中，未检测到结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、无法判读结果的标本例数分别为13例、10例，5例，分别占总检测标本的4.4%、3.4%和1.7%，可用于分析基因芯片法检测结果的267例患者中，19例患者罗氏固体培养结果为阴性，13例患者罗氏比例法表型药敏试验结果失败，因此最后用于基因芯片法结果分析的患者为235例。

三、 仪器和培养基

基因芯片法检测系统和结核分枝杆菌耐多药基因芯片法检测试剂盒购自北京博奥生物有限公司，罗氏培养基及罗氏比例法药敏试验培养基(罗氏含药药敏试验培养基中异烟肼终浓度为0.2 μg/ml,利福平终浓度为40 μg/ml)购自珠海贝索生物技术有限公司。

四、实验室方法

使用N-乙酰半胱氨酸和氢氧化钠溶液(NALC-NaOH)消化一份阳性级别较高的痰标本,尽快将痰样本消化液接种于改良的酸性罗氏培养基斜面，37 ℃ 培养3周左右，再刮取菌落并按照文献[5]的要求进行传统表型药敏试验和菌种鉴定。

吸取1.2 ml消化后的样品，加入1.5 ml离心管中，然后以离心半径16 cm，12 000 r/min离心15 min，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，然后再以离心半径16 cm,12 000 r/min离心5 min，最后按照公司提供的说明书进行基因芯片操作[10]。

内蒙古自治区第四医院结核病参比实验室的工作人员均通过国家结核病参比实验室培训和认可。在本研究开始之前，已进行了2个月的试运行，以确保参与本研究的实验室人员能够熟练操作基因芯片耐药检测技术。

五、统计学处理

使用SPSS 15.0统计学软件对本研究的数据进行整理分析。统计不同阳性级别样本中检测结果包括正常、无法判断和无分枝杆菌，采用Mantel-Haenszel卡方检验分析痰标本中结核分枝杆菌阳性级别与有无结果是否存在线性关系，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、基因芯片检测利福平耐药性的效能评价

231例患者的罗氏比例法药敏试验结果和基因芯片法检测结果一致，一致率为98.3%；利福平罗氏比例法药敏试验结果耐药的23例患者中，基因芯片法检测结果为耐药22例，敏感度为95.7%(22/23)；利福平罗氏比例法药敏试验结果为敏感的212例中，基因芯片法检测结果为敏感209例，特异度为98.6%(209/212)；此外，基因芯片法检测利福平耐药性的阳性预测值和阴性预测值分别为88.0%(22/25)和99.5%(209/210) (表1)。

二、基因芯片检测异烟肼耐药性的效能评价

228例患者罗氏比例法药敏试验结果和基因芯片法检测结果一致率为97.0%(228/235);异烟肼罗氏比例法药敏试验结果耐药的20例患者中，基因芯片法检测结果为耐药者16例，敏感度为80.0%(16/20);异烟肼罗氏比例法药敏试验结果敏感的215例患者中，基因芯片法检测结果为敏感的212例患者，特异度为98.6%(212/215)。基因芯片法检测异烟肼耐药性的阳性预测值和阴性预测值分别为84.2%(16/19)和98.1%(212/216) (表1)。

三、基因芯片法检测耐多药肺结核的效能评价

同时具有罗氏比例法药敏试验和基因芯片法检测结果的235例患者中， 224例患者罗氏比例法药敏试验和基因芯片法检测耐多药的一致率为95.3%(224/235)。在罗氏比例法药敏试验诊断的21例耐多药肺结核患者中，基因芯片法检测结果为耐多药肺结核患者16例，敏感度为76.2%(16/21)；罗氏比例法药敏试验诊断为非耐多药肺结核的214例患者中，基因芯片法检测为非耐多药肺结核的患者208例，特异度为97.2%(208/214)。基因芯片法检测耐多药肺结核患者的阳性预测值和阴性预测值分别为72.7%(16/22)和97.7%(208/213)(表1)。

四、痰标本中结核分枝杆菌阳性级别对基因芯片法检测结果的影响

标本中结核分枝杆菌阳性级别(阳性等级)[5]表示标本中结核分枝杆菌浓度的水平，可能对基因芯片的结果产生影响。分析结果表明，随着标本阳性级别的提高，无结果构成比不断降低，其中“实际条数”和“++++”标本中无结果构成比分别为20.0%和1.5%；有无结果与标本阳性级别之间存在线性关系，随着标本阳性级别上升，无结果构成比呈下降趋势(R=7.971，P<0.01)(表2)。

讨 论

一、基因芯片法检测耐药肺结核的效能评价

基因芯片可检测痰标本中结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性相关基因[11]，特别是该方法可以直接检测痰及其他临床样本。与传统药敏试验相比，基因芯片法检测具有诸多优点。首先，基因芯片法检测时间更短，一般在6 h内可完成全部检测过程，因此可为临床医生及时制定有效的结核病治疗方案节省时间；其次，本方法是检测结核分枝杆菌核酸，而非直接对结核分枝杆菌的操作，因此，基因芯片法比罗氏比例法药敏试验更安全；最后，基因芯片法检测样本通量较高，可节省实验室工作人员的时间[12]。

表1 以罗氏比例法药敏试验为参考标准评价基因芯片法对利福平和异烟肼耐药性的诊断效能

表2 标本阳性级别对基因芯片法检测结果的影响[例(构成比，%)]

国内开展基因芯片法检测结核分枝杆菌耐药性研究多针对结核分枝杆菌菌株的检测，基于患者痰标本进行基因芯片法检测的研究较少[12]。2019年一项在地(市)级结核病实验室对基因芯片法检测评估结果中，利福平耐药性检测的敏感度和特异度分别为89.0%和96.1%；对异烟肼耐药性检测的敏感度和特异度分别为80.2%和96.7%[13]。本研究结果与其结果相近，提示直接从痰标本开展基因芯片法检测能够快速准确发现利福平及异烟肼耐药的患者，具有良好的临床应用价值。

二、基因芯片与同类检测方法比较

基因芯片和线性探针都是通过反向杂交检测结核分枝杆菌耐药相关基因的检测技术，线性探针检测利福平耐药性总体敏感度和特异度分别为91.0%和98.0%，检测异烟肼耐药性的总体敏感度和特异度为80.0%和98.0%[14]，与本研究结果类似。这与两种方法检测的原理高度相似，且覆盖的耐药基因的数量及区域相似有关。但是本研究也发现，对于异烟肼耐药性检测敏感度约为80.0%，即20.0%的异烟肼耐药患者并未携带katG基因和inhA基因突变，提示存在其他的异烟肼耐药相关基因突变导致上述菌株产生对异烟肼的耐药性。近期的一项基于我国异烟肼耐药菌株的分子流行病学研究表明，有超过10%的异烟肼耐药菌株携带oxyR-ahpC基因区域的突变[15]，鉴于此，建议在基因芯片及其他异烟肼耐药检测的分子生物学产品中将oxyR-ahpC基因纳入到检测靶标中，以提高基因芯片对于异烟肼耐药性的诊断效能。

三、标本涂片阳性级别对基因芯片法检测结果的影响分析

痰标本阳性级别是反映痰标本中结核分枝杆菌含量的有效指标，基因芯片基于对结核分枝杆菌耐药相关基因扩增检测，因此不同阳性级别的标本可能对其结果产生影响。本研究发现随着痰标本阳性级别的不断降低，无结果的比例显著提高，尤其是阳性级别为实际条数的标本，无结果占比高达20.0%，这个结果提示基因芯片法检测对于痰标本为实际条数级别的标本检测结果可能在实际临床使用过程中需要慎重。同时该部分结果提示在部分高阳性级别的标本中发现无检测结果的情况，其中阳性级别为“++++”的标本中检测无结果者的占比为1.5%，这可能是由于该阳性级别的部分标本为血痰或者干酪样痰，该类痰中蛋白含量较高，可抑制基因芯片的扩增反应，从而影响了结果的可读性。然而，标本的阳性级别对诊断结果的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值方面的影响不大，表明基因芯片法检测所获得的结果具有较高的准确性。

根据之前的文献提示，大约90%的耐利福平结核病患者对异烟肼也有耐药性[16]。换言之，90%的耐利福平结核病患者患有耐多药结核病。因此，对利福平是否耐药被用于诊断耐多药结核病的标志物[15-16]。在本研究中，有76.2%(16/21)对利福平耐药的结核病患者对异烟肼耐药，上述结果与近期的一项来自我国的荟萃分析结果类似[17]，提示在我国采用对利福平是否耐药用于耐多药结核病的诊断可能导致近1/4的患者失去使用异烟肼的机会，建议对利福平耐药的患者同时开展对异烟肼是否耐药的检测，以明确耐多药结核病的诊断。

本研究表明，基因芯片法检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性具有较高的敏感度和特异度。在实验室条件允许的情况下，笔者认为痰标本基因芯片法检测耐多药肺结核与罗氏比例法药敏均具有较高的临床诊断价值，而基因芯片法是一种更有效、快速、安全、成本-效益更高的替代技术，是一种可在我国结核病实验室进行耐药性检测的备选方法。