胃泰胶囊质量标准提升及指纹图谱研究

王 珺,梁承远

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安 710021；2.青海省药品检验检测院 青海省中藏药现代化重点实验室，青海 西宁 810000)

0 引言

中药是在中医理论指导下使用的药品制剂，中药质量标准的制定应该全面考虑药品的有效性、安全性、制备工艺、制剂要求等因素，以提取完整的能表征药品性质的质量控制指标，成为药品质量标准依据[1-4].同时，应当快速促进中药质量标准现代化研究，通过更加全面、科学的标准，让中药制剂质量标准趋于优质化、标准化、现代化，全面提高中药制剂质量标准化的水平[5]，从而更好的保证中药质量，促进中药优良发展.

胃泰胶囊由南寒水石、诃子、砂仁、丹参、高良姜、醋香附、檀香、五灵脂八味药组成，制剂工艺如图1所示.功能主治为温中和胃、行气止痛，常用于脾胃虚弱、凝气滞所致的胃脘冷痛、痞痛不舒，以及胃十二指肠溃肠见上述证候者.胃泰胶囊为独家品种，由青海晶珠藏药高新技术产业股份有限公司生产，批准文号为：国药准字Z20025087，现行质量标准为《国家食品药品监督管理局国家药品标准》WS-10081(ZD-0081)-2002-2012Z.

图1 胃泰胶囊工艺制法

胃泰胶囊为常用胃病药，畅销全国，但是原质量标准存在以下问题：丹参中丹参酮IIA薄层色谱鉴别中样品对应斑点不显示；五灵脂薄层色谱鉴别中样品与对照药材斑点不一致；高效液相色谱法对丹参酮IIA含量测定时样品中丹参酮IIA的色谱峰极小且不稳定.原有质量标准无法控制药品质量，且制剂在流通过程中也因为原质量标准问题被判抽验不合格，给企业造成严重损失，基于此迫切需要开展相应研究工作.本实验修订了五灵脂、丹参的薄层色谱鉴别，同时增加了南寒水石的显微鉴别和檀香的薄层色谱鉴别，重新选择控制丹参质量的特征成分并优化了HPLC方法，并且采用UPLC制定了胃泰胶囊的指纹图谱，从而全方位的掌握制剂质量，保证药品质量标准更加科学合理，促进药品流通更加通畅可靠[6,7].

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 试药与试剂

没食子酸对照品、丹酚酸B对照品、丹参酮IIA对照品、丹参对照药材、五灵脂对照药材、檀香对照药材均来源于中国食品药品检定研究院.试剂均为分析纯，水为超纯水，10批胃泰胶囊.

1.1.2 主要仪器

Agilent1260高效液相色谱仪、Waters Acquity超高效液相色谱仪、XS105DU电子天平(上海梅特勒有限公司)、BSA224S-CW电子天平(赛多利斯有限公司)、KQ5200V超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司)、101A-1E电热鼓风干燥箱(上海实验仪器厂有限公司)、ATS4薄层色谱点样仪(瑞士卡玛)、HH-6数显恒温水浴锅(江苏国华电器有限公司)、Olympus BX53显微镜(奥林巴斯公司).

1.2 显微鉴别

中药制剂显微鉴别研究一般常用于生粉投料的药材的质量控制，具有简便、快速的特征，是中药传统鉴别的重要手段[8].南寒水石为生粉投料，显微观察特征明显，可具体描述为：晶体呈长方形或不规则块状，部分可见的晶体薄片结构层层叠加在一起，偏光下有白色或彩色的光泽(南寒水石)[9,10].若制剂中含有此特征可判定为含有南寒水石.

1.3 薄层鉴别[11]

1.3.1 没食子酸的薄层色谱

取本品内容物5 g，加三氯甲烷30 mL，加热回流30分钟，放冷，滤过，药渣挥尽三氯甲烷后，加乙酸乙酯30 mL，加热回流30分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至1 mL，作为供试品溶液.另取诃子对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液.再取没食子酸对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液.吸取对照品溶液4μL，其余溶液5～10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液，在日光下检视.

1.3.2 丹参的鉴别研究

取本品内容物3 g，加乙醇25 mL，超声1小时，滤过，滤液蒸干，加2 mL乙醇使溶解，作为供试品溶液.另取丹参对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液.吸取上述两种溶液2～5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶4∶8∶1∶4)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视.

1.3.3 五灵脂的鉴别研究[12]

取本品内容物5 g，加三氯甲烷20 mL，超声处理15分钟，滤过，药渣挥尽三氯甲烷后，加70%乙醇30 mL，加热回流30分钟，放冷滤过，滤液蒸干，残渣加水30 mL，搅拌使溶解，加稀盐酸调pH值至2，用乙酸乙酯提取2次(30 mL、20 mL)，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液.另取五灵脂对照药材1 g，加乙酸乙酯10 mL，加热回流10分钟，滤过，滤液浓缩至约1 mL，作为对照药材溶液，吸取供试品溶液10～15μL、对照药材溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(8∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视.

1.3.4 檀香的鉴别研究

取本品内容物10 g，加水200 mL和正己烷2 mL，用挥发油提取器加热回流2小时，放冷，移取正己烷层，作为供试品溶液.另取檀香对照药材1 g，加水100 mL和正己烷1 mL，同法制成对照药材溶液.吸取上述两种溶液5～10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60 ℃～90 ℃)-乙酸乙酯(17∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视.

1.4 含量测定

查阅文献可知，丹参有两大类主要成分，一类是水溶性成分，如丹酚酸B、原儿茶醛、迷迭香酸等，具有较强的抗脂质过氧化和清楚自由基作用，其中丹酚酸B是含量最高的成分[13].一类是脂溶性丹参酮类成分如：丹参酮Ⅰ、丹参酮IIA、隐丹参酮类等，其在高温极易分解[14,15].

胃泰胶囊处方工艺中丹参为70%乙醇加热回流三次，提取液经过滤、浓缩、烘干、粉碎制成颗粒备用，整个工艺过程中丹参被极性较大的溶剂反复高温加热提取，造成在制剂中难以检测出脂溶性的、稳定性较差的丹参酮IIA，经过实验，发现水溶性成分丹酚酸B可以检出，经一系列方法学考察，最终确立检测丹酚酸B(结构如图2所示)的高效液相色谱方法考察制剂中的丹参含量.

图2 丹酚酸B结构图

1.4.1 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(本次实验用Agilent EcLipse XDB-C18(5μm，4.6×250 mm)；以乙腈-0.1%磷酸溶液(22∶78)为流动相；流速为1.0 mL/min；柱温为25 ℃；检测波长为286 nm；进样量为10μL.

1.4.2 溶液的配制

供试品溶液的制备：取本品10粒，粉末混匀，精密称取2 g，置棕色锥形瓶中，精密加70%甲醇50 mL，称定重量，超声处理1小时，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失重量，充分振摇，过滤，取续滤液(弃去初滤液)，即得.

阴性样品溶液的制备：按处方比例及制备工艺，制备丹参的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成不含丹参的阴性样品溶液.

丹酚酸B对照品，供含量测定用，冷冻保存，含量以94.1%计，使用前无需处理)21.42 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀即得浓度为0.403 1 mg/mL的丹酚酸B对照品溶液.

1.5 指纹图谱

中药指纹图谱是表征样品整体状况的一种手段，相似度可以量化指纹图谱的相似性，中药制剂的指纹图谱研究对于考察药品的稳定性、同一性具有良好意义[16,17].故本实验建立了胃泰胶囊的指纹图谱研究方法，如下：取胃泰胶囊粉末2 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50 mL乙酸乙酯，称定重量，超声处理30分钟，再次称定重量，用乙酸乙酯补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液作为供试品溶液.10批胃泰胶囊溶液分别注入超高效液相色谱仪测定分析，流动相A为0.1%磷酸溶液，B为甲醇，梯度洗脱(0～9 min，95%～70% A；9～12 min，70%～54% A；12～34 min，54%～5% A)；流速0.3 mL/min，进样量10μL，检测波长270 nm.

2 结果与讨论

2.1 显微鉴别结果

在图3中，可见南寒水石显微特征明显；在图4中，可见胃泰胶囊中南寒水石显微特征明显.因此，可判断制剂中含有南寒水石.

(a)日光 (b)偏光图3 南寒水石生粉显微特征，标尺20 μm

(a)日光 (b)偏光图4 制剂中南寒水石显微特征，标尺20 μm

2.2 薄层色谱鉴别结果

10批胃泰胶囊的显微鉴别方法和没食子酸、丹参、五灵脂、檀香的薄层色谱鉴别方法均可行，都可检出.砂仁、高良姜、香附的薄层鉴别方法因存在阴性干扰，定性研究方法未成功，达到了对所有药味的探索研究.图5为诃子的薄层色谱图，供试品在与诃子对照药材色谱和没食子酸对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点；图6为丹参的薄层色谱图，供试品在与丹参对照药材色谱相应位置上显相同的蓝色的荧光斑点；图7为五灵脂的薄层色谱图，供试品在与五灵脂对照药材色谱相应位置上显一个红色的荧光斑点；图8为檀香的薄层色谱图，供试品在与檀香对照药材相应位置上显一个亮蓝色的荧光斑点.

(a) 薄层色谱图

(a) 薄层色谱图

(a) 薄层色谱图

(a) 薄层色谱图

2.3 含量测定结果

2.3.1 方法学考察结果

(1)专属性实验

取丹酚酸B对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，以上述色谱条件进样，其结果如图9所示.由图可知，丹酚酸B对照品和样品中丹酚酸B保留时间一致，且峰型对称，理论塔板数大于5 000，且阴性样品色谱在与对照品出峰位置相应保留时间附近无干扰峰出现，表明阴性无干扰，方法专属性良好.

a:样品；b:丹酚酸对照品；c:胃泰胶囊样品图9 专属性HPLC图

(2)线性范围考察

精密量取丹酚酸B对照品溶液(浓度为0.403 1 mg/mL)2 mL，分别置5 mL、10 mL、25 mL、50 mL、100 mL的棕色容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，按上述色谱条件，分别精密吸取10μL注入液相色谱仪，记录峰面积.以对照品进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积A为纵坐标(Y)，进行线性回归分析，得回归方程Y=1 280.2X-108.04，R2=0.999 8.由此可知,10批样品峰面积均在线性范围内，表明样品中丹酚酸B在0.080 6～4.031 0μg范围内具有良好的线性关系.

(3)精密度试验

精密吸取丹酚酸B对照品溶液(浓度为0.403 1 mg/mL)连续进样6次，每次10μL，记录色谱峰峰面积，连续进样6次，丹酚酸B的RSD为0.72%，精密度良好.

(4)重复性试验

取同一批号胃泰胶囊6批，分别制备6份供试品溶液，进样量均为10μL，测定.同一批次的6批样品中丹酚酸B的RSD为0.34%.

(5)稳定性试验

取同一批胃泰胶囊溶液，每间隔4小时进样1次，重复进样6次，进样量为10μL，记录色谱峰面积，计算样品中丹酚酸B的色谱峰峰面积在20小时内进样的RSD为0.25%，表明样品溶液的稳定性在20小时内良好.

(6)准确性试验

取同一批胃泰胶囊粉末适量，精密称定6份，置棕色锥形瓶中，分别精密加入4 mL丹酚酸B对照品溶液(0.403 1 mg/mL)，按上述供试品溶液制备方法制备加样回收样品溶液.分别精密进样10μL，计算加样回收样品的含量，从而得到丹酚酸B平均回收率为95.741 4%，回收率在95.179 5%～96.195 8%之间，RSD值为0.43%，数据如表1所示.结果表明本方法回收率良好.

表1 准确性实验结果

(7)耐用性考察

实验分别考察了该方法在不同色谱柱在安捷伦1260高效液相色谱仪上的耐用性，选取同一批样品溶液，采用Phenomenex Luna C18色谱柱、Hypersil BDS C18色谱柱、Agilent Zorbax SB-C18色谱柱分离分析和检测，柱子规格均为(250 mm×4.6 mm，填料内径5μm)，其结果如图10所示.由图可知，三种色谱柱分离样品中的丹酚酸B，分离度良好，表明该方法在不同C18色谱柱耐用性良好.

a:Phenomenex Luna C18；b:Hypersil BDS C18；c:Agilent Zorbax SB C18图10 不同色谱柱考察

(8)流动相选择及检测波长选择结果

卢召战等[18]在《pH及添加剂对丹酚酸B水溶液稳定性的影响》一文中提出：弱酸环境有利于丹酚酸B的稳定，强酸及碱性环境中，丹酚酸B均发生分解，故流动相采用0.1%磷酸溶液.为确定其最大吸收波长，进行紫外全波长扫描，结果如图11所示.最终选择286 nm为其检测波长.

图11 丹酚酸B紫外扫描图

2.3.2 样品测定结果

对10批胃泰胶囊样品进行含量测定，结果如表2所示.丹酚酸B含量在3.482 9～4.338 1 mg/粒之间，平均值为4.023 6 mg/粒，10批样品含量范围符合规定，同一生产企业批间稳定性良好.

表2 10批样品中丹酚酸B样品测定结果

但是在胃泰胶囊质量标准改进工作中发现，在含量测定时按实验室常规操作，样品溶液和对照品溶液进样前需要用0.45μm的微孔滤膜滤过，实验发现丹酚酸B对照品直接滤过后的续滤液和弃去初滤液之后的续滤液两者差距较大.微孔滤膜对丹酚酸B吸附较强，建议弃去至少2 mL初滤液后，使用之后的续滤液进样.

2.4 指纹图谱结果

对10批样品的进行UPLC指纹图谱测定，其样品色谱叠加图如图12所示.采用chempattern软件对色谱图进行数据处理和分析，随机选一个样品作为代表性样品，进行相似度计算，结果如图13所示.10批样品的相似度大于0.99，相似度高，符合指纹图谱的要求.

图12 UPLC指纹图谱叠加图

图13 样品相似度图

3 结论

药品质量标准是药品检验的法律准绳，科学合理的质量标准必须紧密围绕处方功效和制备工艺，在制定药品质量标准时应综合考量影响因素.本研究通过对10批中成药胃泰胶囊进行质量标准改进研究，修正并完善了原有质量标准，建立了定性鉴别南寒水石(显微鉴别)，诃子、丹参、五灵脂、檀香(四味药材的薄层色谱鉴别)的方法和定量控制丹参中的丹酚酸B的方法，并增加了UPLC法测定胃泰胶囊指纹图谱的方法，且实验结果显示：按着改进后的药品标准检验，10批胃泰胶囊均符合规定，且质量较稳定.

此外检验不是目的，保障药品安全有效，稳定可控才是关键.为促进中药现代化发展，源头把控才是重中之重，药材好，药才好，中药的可持续发展需要大家的共同努力.