液质联用法检测牛奶中金刚烷胺的药物残留

张秀妍 葛祥武 王 骏 大连市检验检测认证技术服务中心（辽宁，大连，116023）王慧龙 大连理工大学（辽宁，大连，116023）

金刚烷胺是金刚烷的衍生物， 属于三环胺类，是人用抗病毒药物，许多国家在家禽畜牧业生产中已明确禁止使用金刚烷胺，但仍然存在非法使用的情况［1］，我国农业部公告第560 号《兽药地方标准废止目录》规定，金刚烷胺不得检出。

目前，对金刚烷胺的检测较多，但多集中于鸡肉、鸡蛋等畜产品，对牛奶中金刚烷胺检测的研究较少，本论文对牛奶中金刚烷胺的检测方法进行建立、优化。

1 实验方法

1.1 样品采集及准备

实验中用到的牛奶为生鲜乳， 采自养殖场，冷冻备用。

1.2 仪器设备

I-Class 高效液相色谱（美国Waters 公司）；TQS 三重四级杆串联质谱仪（美国Waters 公司，配有电喷雾ESI 源）；超纯水仪（美国Millipore 公司）；冷冻离心机（日本HITACHI 公司）；氮吹仪；涡旋振荡器；固相萃取装置；电子天平等。

1.3 药品与试剂

金刚烷胺溶液标准物质（1 000μg/mL，上海安谱实验科技股份有限公司）、金刚烷胺-D15 溶液标准物质（10μg/mL，农业部农产品质量标准研究中心）。

Bond Elut C18 小柱 （Agilent，100mg/3mL）；乙腈（色谱纯，Fisher）；冰乙酸（优级纯，天津凯信化学工业有限公司）；磷酸二氢钾（优级纯，天津科密欧公司）；甲酸（优级纯，Thermo 试剂）等。

0.1%的甲酸乙腈溶液：取1mL 甲酸用乙腈定容至1L；

0.1%的甲酸水溶液：取1mL 甲酸用超纯水稀释至1L；

1.8%的三氯乙酸乙腈水溶液：称取20g 三氯乙酸溶于10%的乙腈水溶液中；

磷酸盐缓冲溶液0.1mol/L：称取13.6g 磷酸二氢钾，用水定容至1L，用10.0mol/L 的氢氧化钠调PH至6.9-7.1 。

1%的冰乙酸乙腈溶液：取10mL 冰乙酸用乙腈稀释至1L。

1.4 配制标准溶液

移取金刚烷胺溶液0.1mL 用乙腈定容至100mL， 配成浓度为1.0μg/mL 的混合外标中间溶液，用乙腈稀释成100ng/mL 外标混合使用溶液。 移取金刚烷胺-D15 溶液1mL，用乙腈定容至100mL，配成100ng/mL 内标使用溶液。

1.5 样品前处理

1.5.1 提取

准确称取牛奶2.0g，置于50mL 塑料离心管中，加入0.1mL 内标使用溶液， 震荡混匀； 加入10mL 1%的冰乙酸乙腈溶液， 以2 000rpm 的速度涡旋振荡1min，4℃，9 000rpm 离心10 分钟，上清液移入另一离心管中。 再加入10mL 1%的冰乙酸乙腈溶液，重复提取一次， 离心后合并上清液，45℃氮气吹干，加入2.5mL 磷酸盐缓冲液，涡旋振荡，待净化。

1.5.2 净化

C18 小柱依次经2.5mL 乙腈、2.5mL 磷酸盐缓冲液活化后， 将1.5.1 的提取液过柱， 待自然流干后，用2.5mL 超纯水洗柱，加压挤干。用1mL 0.1%的甲酸乙腈水溶液（3∶7）洗脱，收集洗脱液，过0.2μm有机系滤膜后上机测定。

1.6 仪器条件

色谱条件：Waters BEH C18 反相色谱柱（2.1mm×100mm，粒度1.7μm）；柱温为35℃；进样量为2μL； 流动相为0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液（8：92，V/V）；流速为0.3 mL/min。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正离子扫描模式；去溶剂气温度：500℃；雾化气、干燥气为高纯氮气，气体流量为800L/Hr；碰撞气为氩气，输出压力为0.07MPa；离子模式：多反应监测扫描模式；选择反应监测母离子（Parent ion）、子离子（Product ion）、碰撞能量（CE）和锥孔电压（CV）质谱参数。 （见表1）。

表1 金刚烷胺和氟喹诺酮类药物质谱条件

2 结果与讨论

2.1 提取试剂的确定

测定牛奶的基质干扰物主要为脂肪和蛋白质，为了提高检测灵敏度，降低基质干扰，需要将样品进行适当的净化和浓缩。 因金刚烷胺在乙腈中的溶解性较好，且乙腈有沉淀蛋白的作用，同时对样品中脂肪的提取率比较低， 故选择乙腈为提取溶剂。在商检标准SN/T4253-2015 中［2］，用三氯乙酸乙腈水溶液提取金刚烷胺等抗病毒类药物，本论文综合考察乙腈、1%的甲酸乙腈溶液、1.8%的三氯乙酸乙腈水溶液、2%的冰乙酸乙腈溶液的提取效果， 三氟乙酸的乙腈水溶液和1%的甲酸乙腈溶液， 提取效果均较好，但考虑到三氟乙酸处理不彻底会造成质谱的损害［3］，本论文选用1%的甲酸乙腈溶液为牛奶中金刚烷胺的提取溶液。

2.2 固相萃取小柱的确定

在研究牛奶中金刚烷胺的检测方法时，仲伶俐等人采用HLB 小柱，对磷脂和蛋白具有很好去除作用。 赵静等人在对牛奶和奶粉中维吉尼霉素残留量的测定中，采用C18 小柱对牛奶进行净化［4］，商检标准SN/T4253-2015 中，用混合阳离子交换固相萃取小柱净化， 在比较了这三种小柱的净化洗脱效果后，本论文选用具有高键合度、低流失、高回收率、选择性广、对金刚烷胺净化洗脱效果好、回收率较高的C18 小柱。

2.3 工作曲线的绘制

称取5 份牛奶空白样品，每份2g，分别置于50mL离心管中，加入金刚烷胺标准使用溶液，处理后上机的浓度梯度依次为0.5、1.0、2.0、5.0 和10.0 ng·mL-1，其中同位素内标的含量为10.0 ng·mL-1。 金刚烷胺以金刚烷胺-D15 为内标物进行定量计算。 按照1.5 进行样品前处理、1.6 仪器条件上机检测，数据处理选用内标法，工作曲线方程为y=1.03017x-0.03579，线性相关系数R2为0.999631， 其中y 为外标和内标峰面积的比值，x 为外标和内标浓度的比值，结果表明，金刚烷胺在1.0μg·kg-1～10μg·kg-1范围内线性关系良好。

2.4 方法的定量限

采用空白样品添加低浓度的标准溶液，按1.5、1.6 进行测定，以信噪比S/N≥10 确定金刚烷胺的定量限，为1.0μg·kg-1［5-6］，满足金刚烷胺药物残留的检测要求。

2.5 准确度和精密度

本方法的准确度通过测定加标样品的平均回收率来确定，精密度通过计算平均回收率的相对标准偏差来确定。 在称样量为2g，加标样品的添加浓度分别为1、2、10μg·kg-1、每个添加浓度做6 个平行样品，按1.5、1.6 进行准确度和精密度实验［7］，平均回收率在80%～112%之间， 相对标准偏差小于10%， 说明该方法具有较高的准确度和较好的精密度，满足牛奶中金刚烷胺药物残留的检测要求。 添加浓度为2μg·kg-1的加标样品测得的质谱图，保留时间为145min。 （见图1）。

图1 金刚烷胺和氘代金刚烷胺加标溶液质谱图

3 结论

本研究建立了牛奶中金刚烷胺的检测方法，定量限为1.0μg·kg-1， 线性范围为0.5ng·mL-1～10ng·mL-1，批内相对标准偏差小于10%，重复性较好，满足牛奶中金刚烷胺的检测要求。