益生菌发酵苹果浊汁贮存期品质分析与货架期预测模型

高振鹏 孟掉琴 王 瑜 吴 霞 任耀鹏 岳田利

(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院， 陕西杨凌 712100； 2.农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(杨凌)， 陕西杨凌 712100)

0 引言

苹果浊汁经益生菌发酵后被赋予新的风味，同时可以通过代谢产生抑菌物质，延长苹果浊汁的货架期[1-3]。但是由于含有活的益生菌，在存放期间益生菌继续增殖及后酸化，使苹果浊汁的品质受到一定影响。要确保苹果浊汁稳定、不褐变、口感好及活菌菌体浓度高，需要准确预测益生菌发酵苹果浊汁的货架期。

食品在贮藏过程中各项指标的变化是控制产品质量的重要因素，这些指标影响食品的货架期。食品货架期指食品理化性质、微生物、风味、感官等品质指标保持最优的时间长度[4-5]。近年来，动力学模型被广泛应用于食品货架期模型的研究中，Arrhenius方程是描述食品货架期指标变化反应速率常数与温度的方程，通常被用来构建一些预测模型，以进行食品货架期的预测[3]。目前，研究者利用动力学模型建立了湿米线、酸奶及双胞蘑菇等产品货架期的预测模型[6-8]。

目前，尚未见有关益生菌发酵苹果浊汁产品货架期预测模型的研究报道。本文探究不同贮藏温度下益生菌发酵苹果浊汁各项基础理化指标及香气成分的变化，为获得货架期长、营养成分高的发酵苹果浊汁提供理论依据，同时，构建益生菌发酵苹果浊汁货架期预测模型，为发酵苹果浊汁的贮藏和销售提供一定的技术支持和理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

长富、秦冠苹果，均购自陕西省杨凌示范区市场；嗜酸乳杆菌 6005(Lactobacillusacidophilus)、植物乳杆菌21805(Lactobacillusplants)、发酵乳杆菌 21828(Lactobacillusfermentum)，均保存于西北农林科技大学食品科学与工程学院健康食品制造与安全控制实验室。

MRS培养基，北京陆桥技术股份有限公司；苹果酸、乳酸、柠檬酸、丙酮酸、琥珀酸、酒石酸，分析纯，纯度98%以上，上海源叶生物科技有限公司；蔗糖、果糖、葡萄糖，色谱纯，上海源叶生物科技有限公司；2-辛醇，GC标准品，日本东京化成工业株式会社。

1.2 仪器与设备

2000JP-1型离心果汁机，南通金橙机械有限公司；WMC-9005A/T型5 L发酵罐，上海万木春生物工程有限公司；UV-1240型紫外/可见分光光度仪，日本岛津公司；Ci7600型色度仪，爱色丽(上海)色彩科技有限公司；LC-15C型液相色谱仪，日本岛津公司；TRACE1310-ISQLT型气相色谱质谱联用仪，赛默飞尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1苹果浊汁的制备

在文献[9]制备苹果浊汁工艺的基础上进行2 500 r/min离心、20 MPa均质处理，增加浊汁的稳定性。

1.3.2发酵培养条件

将种子液(嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌体积比1∶1∶1)[9]按10%接种量接种于装有2 L苹果浊汁的发酵罐中，发酵温度为37℃、发酵时间24 h，不补料。

1.3.3指标测定方法

发酵结束后将发酵果汁分装于100 mL玻璃瓶，分别置于4℃和25℃下避光贮存，贮藏的样品每隔7 d取样，测定各项品质指标，使用SPSS 20.0进行数据分析。

(1)品质指标测定

活菌菌体浓度测定采用倾注平板法[10](GB 4789.35—2016)；感官评定采用9点快感标度法[11]。

稳定系数的测定：在4 200 r/min下苹果浊汁被离心15 min，660 nm下测定离心后上层液体和离心前果汁的吸光度。采用稳定系数对果汁稳定性进行表征，稳定系数为660 nm下果汁离心后与离心前的吸光度比值[12]，这个比值越大，说明离心后果汁中的悬浮物沉降得越少，果汁越稳定。

色泽稳定性的测定采用色差仪法：使用色差仪对仪器背景校准后，测定L*、a*、b*，用ΔE表示总色差，表征果汁颜色的变化，计算公式[13]为

(1)

式中L*——待测样明暗度(黑白值)

a*——待测样红绿值

b*——待测样黄蓝值

(2)有机酸含量测定

将发酵苹果浊汁离心取上清液，经0.45 μm滤膜过滤上样，对苹果汁中的7种有机酸进行定量分析[14]。

色谱条件：Waters x Terra MS C18型色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A相为100%甲醇，B相为0.01 mol/L (NH4)3PO4(pH值为2.7)；梯度洗脱条件：0～8 min，A相60%；8～15 min，A相100%；样品进样量10 μL；样品流速0.7 mL/min；柱温30℃。

检测器：紫外检测器(DAD)，检测波长210 nm。

(3)糖含量测定

将发酵苹果浊汁离心后取上清液，0.45 μm滤膜过滤后上样，对发酵苹果浊汁中的葡萄糖、果糖、蔗糖含量进行定量分析[15]。

色谱条件：色谱柱为Sugar-Pak TM I(Waters)及保护柱；流动相：85%乙腈；样品进样量20 μL，流速0.6 mL/min，柱温80℃；检测器：示差折光检测器，检测池温度35℃。

(4)香气成分测定

采用顶空固相微萃取(Head-space solidphase micro-extraction, HS-SPME)进行香气成分的富集，使用气相色谱-质谱(Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)上机测定。在文献[16]色谱条件基础上改进。将5 mL样品置于20 mL进样瓶中，分别加入1.5 g的NaCl和一定量的内标溶液(2-辛醇)，上机测定。样品在45℃下平衡30 min，经老化的萃取头顶空吸附30 min，然后进行解析。

色谱条件：DB-5MS型毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度250℃，载气为He，流速为1.93 mL/min，不分流进样。程序升温，初始温度40℃，保持3 min后以3℃/min的速度升温至120℃，再以4℃/min的速度升温至160℃，再以6℃/min的速度升温至240℃，保持8 min。

质谱条件：离子源温度为230℃，接口温度为230℃，离子化方式EI，发射能量70 eV，质量扫描范围35～500(质荷比)。

采集到的质谱图与NIST14 library和Wiley library库中的数据匹配，保留匹配度大于85%的物质，使用内标的浓度乘以挥发物的峰面积与内标峰面积的比率来计算香气成分化合物的含量[17]。

1.4 货架期模型建立及验证

1.4.1品质变化反应速率常数确定

利用Excel对试验中各项指标随贮存时间变化的数据进行拟合，根据反应方程，求出对应的零级和一级反应速率常数k，根据决定系数R2，选择合适的动力学模型[5,18-20]。

1.4.2反应活化能确定

根据Arrhenius方程[21]，方程两边取对数，作lnk与1/T之间的关系曲线(T表示贮存温度)，由直线的截距和斜率确定常数A和活化能Ea，公式为

(2)

式中R——气体常数，8.314 J/(mol·K)

1.4.3品质指标预测模型的建立及验证

根据拟合结果，选择不同的模型方程，零级反应模型方程为

y=y0-kt

(3)

式中y——品质指标测试值

y0——品质指标初始测试值

t——贮存时间，d

一级反应模型方程为

lny=lny0+kt

(4)

结合Arrhenius方程，推导出品质指标预测模型，零级动力学预测模型为

(5)

一级动力学预测模型为

(6)

通过计算模型相对误差、偏差度Bf和准确度Af对模型拟合度进行评价[22]。

1.4.4货架期预测模型的建立

将活菌菌体浓度动力学预测模型变形，得到货架期与活菌菌体浓度的关系方程，即不同贮存温度下的货架期预测模型[23]，方程表达式为

(7)

式中S——货架期，d

Ft——货架期结束时品质指标测试值

2 结果与讨论

2.1 不同温度贮存过程中各项指标的变化

2.1.1活菌菌体浓度

不同贮存温度下色差变化值ΔE、稳定系数、活菌菌体浓度及感官评分变化如表1所示。

由表1可知，4℃贮存条件下各项指标均有显著差异，色差变化值ΔE在贮存期间逐渐增加，稳定系数降低，活菌菌体浓度和感官评分也随着贮存时间延长而呈下降趋势。

贮存过程中发酵苹果浊汁ΔE一直在增加，当ΔE≥2时，果汁颜色发生肉眼可见的变化。在4℃、28 d和25℃、21 d时，ΔE大于2，此时发酵苹果浊汁颜色发生了明显改变。这与文献[24]的红肉苹果浊汁冷藏条件下色泽的变化趋势相一致。此外，4℃条件下稳定系数下降趋势较小，28 d时稳定系数达0.26，变化明显比25℃时小，说明温度对稳定系数的影响显著(p<0.05)。

表1 不同贮存温度下品质指标Tab.1 Quality indicators at different storage temperatures

25℃、28 d的贮存条件下，发酵苹果浊汁中活菌菌体浓度仍能达到7.80×107CFU/mL，远高于轻工行业标准规定的大于105CFU/mL的标准。随着发酵结束，发酵苹果浊汁中乳酸菌已进入衰亡期，乳酸菌细胞壁处于低pH值环境，需要更多的能量来维持细胞内的pH值，导致ATP减少，从而乳酸菌因细胞壁破坏而死亡，活菌菌体浓度下降[25]。感官评分是产品贮存期的关键指标，得分高低直接影响其外观品质和口感接受度[26-27]，由表1可知，发酵苹果浊汁感官评分值不断下降，且贮藏温度越高，下降越快。0～7 d期间，温度对发酵苹果浊汁的感官评分无显著影响(p>0.05)，7 d后25℃条件下感官评分下降较快。低温减缓了发酵苹果浊汁的褐变，避免了一些不良反应的发生，4℃、28 d发酵苹果浊汁发酵气息变浓，苹果果香味变淡，较大程度突出了果汁发酵的良好口感和色泽。

2.1.2香气成分

对4℃和25℃贮存条件下发酵苹果浊汁的香气成分进行检测，经质谱分析图谱比对分析后，相似度大于85%的共29种香气成分，其中醇类6种，酯类9种，醛酮类6种，酸类3种，其他类5种。研究贮存期间发酵苹果浊汁香气成分的变化，绘制不同温度下香气物质总质量浓度柱状图，如图1所示。

由图1可知，在0～14 d，发酵苹果浊汁中醇类和酸类物质总质量浓度在增加，14～28 d期间下降；总酯和总醛酮质量浓度随着贮存时间增加而减少，4℃时下降程度小于25℃，可能由于25℃温度过高，造成香气物质逸散，从而质量浓度降低，其他类物质总质量浓度变化不显著。因此，发酵苹果浊汁在低温下贮藏，既能保持苹果浊汁鲜爽的风味，减少香气逸散，保留大部分香气成分，又能通过低温降低果汁发酵产生的轻微涩感和刺喉感，使风味更为柔和。

2.1.3有机酸、糖质量浓度

结合上述结果，本试验测定了4℃条件下发酵苹果浊汁贮存期间的有机酸、糖质量浓度变化，结果如表2所示。

由表2可知，4℃贮存期间发酵苹果浊汁中葡萄糖及果糖含量增加，蔗糖含量下降。4℃条件下，0～21 d期间发酵苹果浊汁中草酸质量浓度从0.33 mg/mL增加到0.39 mg/mL，21 d后不再增加；丙酮酸含量先下降后上升；0～14 d期间乙酸含量增加，14～28 d期间乙酸含量不变。0～7 d期间苹果酸含量下降，主要是乳酸菌在发酵过程中利用苹果酸进行三羧酸循环等生化反应，产生其他酸[28]，从而导致苹果酸含量降低。贮存期间由于乳酸菌的生长消耗糖类物质，产生有机酸，导致有机酸总量增加。

2.2 品质指标预测模型的建立及验证

2.2.1品质指标预测模型的建立

对L*、a*、b*、ΔE、稳定系数、活菌菌体浓度和感官评分随贮存时间变化的数据进行拟合，得到拟合曲线，求出相应的零级和一级反应速率常数k及决定系数R2，结果如表3所示。

由表3可知，b*零级动力学模型的决定系数大于一级动力学模型，L*、a*、活菌菌体浓度、稳定系数和感官评分一级动力学模型的决定系数大于零级动力学模型，因此b*和ΔE选用零级动力学模型，其他指标选用一级动力学模型。

结合Arrhenius方程，作lnk与1/(1 000T)之间的关系曲线，如图2所示。

根据曲线斜率和截距计算得到L*、a*、b*、ΔE、稳定系数、活菌菌体浓度、感官评分的活化能Ea分别为1.49×105、1.87×104、1.84×104、1.65×104、1.19×104、2.05×104、7.9×103J/mol，A分别为1.26×106、111.85、1 525.22、563.52、24.77、2 518.45、2.89。

图1 不同温度贮存下香气物质总质量浓度Fig.1 Histogram of total concentration change of aroma species at different storage temperatures

表2 4℃下贮存期间有机酸、糖质量浓度变化Tab.2 Changes in organic acid and sugar content during storage at 4℃

表3 理化品质在不同贮存温度下的动力学模型参数Tab.3 Parameters of kinetic models of quality at different storage temperatures

将Ea和A代入式(5)和式(6)中，得到各品质指标预测模型。

L*预测模型方程

(8)

a*预测模型方程

(9)

b*预测模型方程

(10)

ΔE预测模型方程

(11)

稳定系数Q预测模型方程

(12)

活菌菌体浓度V预测模型方程

(13)

感官评分W预测模型方程

(14)

2.2.2品质指标预测模型验证

利用各品质指标预测模型方程计算验证组的L*、a*、b*、ΔE、活菌菌体浓度、稳定系数和感官评分预测值，与实测值以1∶1绘制二者相关性曲线。对模型预测值和实测值的相对误差、偏差度和准确度进行计算，结果如表4所示。

由表4可知，各品质指标预测值与实测值的二者相关性曲线决定系数R2均较高，说明预测值与实测值极相关。建立的各品质指标预测模型相对误差均在10%以内，偏差度和准确度均不大于1.04，均在可接受范围内，表明所建模型能够快速准确预测4℃与25℃贮藏条件下发酵苹果浊汁的L*、a*、b*、活菌菌体浓度、稳定系数和感官评分。

图2 4℃与25℃条件下不同品质指标的Arrhenius曲线Fig.2 Arrhenius curves of different quality indicators at 4℃ and 25℃

表4 不同品质指标预测模型的预测值与实测值Tab.4 Predicted and measured values of different quality indicators prediction models

2.2.3货架期预测模型的建立与验证

活菌是发酵制品的重要观测指标，活菌数量决定产品的寿命长短，也决定其营养价值，因此以活菌作为发酵苹果浊汁货架期预测指标，使用SPSS 20.0分析活菌与其他品质指标的相关性，用皮尔逊相关系数表示，结果如表5所示。

表5 活菌菌体浓度与其他指标的皮尔逊相关系数Tab.5 Person correlation coefficient among various indicators and viable counts

由表5可知，发酵苹果浊汁中活菌与其他指标均显著相关，其中与a*和ΔE显著负相关，说明活菌可以作为发酵苹果浊汁的货架期模型预测指标。

根据活菌动力学预测模型，得到发酵苹果浊汁货架期与活菌的关系方程

(15)

式中Vt——货架期结束时活菌菌体浓度

对获得的发酵苹果浊汁货架期模型进行验证，根据模型方程计算4℃和25℃下活菌菌体浓度的货架期预测值，然后与实测值进行比较，如表6所示。

表6 不同温度下发酵苹果浊汁的货架期预测值与实测值Tab.6 Predicted and observed shelf life of cloudy apple juice at different storage temperatures

由表6可知，在4、25℃条件下发酵苹果浊汁货架期预测值与实测值相对误差分别为3.49%和2.98%，均小于10%，说明建立的发酵苹果浊汁活菌菌体浓度货架期预测模型可以很好地预测发酵苹果浊汁在4～25℃的货架期。

3 结论

(1)在4℃和25℃贮存条件下，贮存28 d后发酵苹果浊汁的色泽和稳定系数下降，活菌菌体浓度仍能达到7.80×107CFU/mL，远高于轻工行业标准；在发酵苹果浊汁贮存过程中，共检测到29种香气成分，其中醇类6种、酯类9种、醛酮类6种、酸类3种，其他类5种；贮存期间，酯类总量降低，醛酮总量降低，酸类含量先增加、后减少。

(2)基于Arrhenius方程，建立了发酵苹果浊汁L*、a*、b*、ΔE、稳定系数、活菌菌体浓度和感官评分的预测模型方程。经验证，发酵苹果浊汁模型预测值与实测值相对误差均小于10%，偏差度和准确度不大于1.04，说明模型可以很好地预测发酵苹果浊汁贮存期的L*、a*、b*、ΔE、活菌菌体浓度、稳定系数和感官评分等指标。

(3)在发酵苹果浊汁贮藏过程中，活菌菌体浓度与其他品质指标均呈显著相关，以其建立的4、25℃条件下的发酵苹果浊汁货架期模型预测值与实测值的相对误差小于10%，说明模型可靠、合理，可以准确预测发酵苹果浊汁的货架期。