植物乳杆菌冻干保护剂的筛选及冻干工艺的研究

张 菊， 苏成文， 亓 鹏， 陈 焱， 孙得发

（山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061）

真空冷冻干燥（简称为冻干）是目前制备和保藏微生物的有效方法，冻干是将冷冻技术和干燥技术进行有机结合。微生物在真空冷冻干燥过程中要经受冷冻和干燥两种激烈因素的影响，损伤是难以避免的。乳酸菌在真空冷冻干燥过程中，通常会造成细胞膜通透性发生改变、蛋白质变性失活、pH的动态平衡被打破、DNA发生损伤以及膜脂肪酸组成发生改变等（张英华等，2006）。影响乳酸菌在冻干后效果的因素有很多，如菌株、菌体的大小及其形状、菌种的菌龄、初始菌种的浓度、pH、相应的保护剂系统、预冻的温度、降温的速率、冷冻干燥的条件、细胞的含水量、细胞膜的成分和复水的条件等（李华等，2002），若在冻干的过程中采取一定的保护措施，加入适宜的有效保护剂系统，同时采用适合特定菌株的预冻温度和预冻时间，可以在最大程度上减轻或有效避免真空冷冻干燥对细胞带来的损伤。

低聚糖又称为寡糖，由2～10个单糖分子通过糖苷键聚合而成的直链或支链化合物，其包括功能性低聚糖和普通低聚糖。功能性低聚糖一般很难被消化吸收，但是可以被肠道中的微生物发酵利用。其具有增加胃肠道蠕动、提高机体免疫力、抗病毒、抑制腐败菌生长、促进有益菌增殖等一系列特殊的生理保健作用。功能性低聚糖作为冻干保护剂，具有保健和冻干保护的双重作用，可以使益生菌维持较高的成活率；当机体食入功能性低聚糖作为益生菌冻干保护剂的产品后，功能性低聚糖将继续发挥益菌保健、促生长的作用（王莹等，2010），功能性低聚糖可以将益菌作用和冻干保护作用结合起来，将在医药、食品和饲料生产中发挥重要的作用。

本试验选择目前益菌和促菌生长效果比较好的功能性低聚糖：低聚木糖、低聚果糖、水苏糖、低聚异麦芽糖，分别研究其对植物乳杆菌冻干后的保护效果，选择其中一种功能性低聚糖作为冻干保护剂。再与目前乳酸菌冻干效果比较好的脱脂奶粉、海藻糖和甘油复配，通过正交试验对其浓度进行优化。同时对冻干工艺进行初步探索，旨在为植物乳杆菌的冻干保护研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌种和培养基 植物乳杆菌：本实验室保存的菌种。

培养基：MRS固体和液体培养基。

1.2 原料 低聚木糖、低聚果糖、水苏糖、低聚异麦芽糖、海藻糖（纯度＞99%）和脱脂奶粉为食品级，甘油为化学纯。以上保护剂分别用蒸馏水配制成高浓度的贮备液，单独灭菌后，按试验设计配制成各种复合保护剂。

1.3 仪器与设备 微生物实验室常用的仪器设备为：FDU-1100真空冷冻干燥机（日本，东京理化），SW-CJ-2F垂直流双人双面净化工作台 （江苏，苏州净化），DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱（西安禾普）和DHP-360数显电热恒温培养箱（江苏，金坛市天竟实验仪器厂），TCYQ DHZ-CA大容量振荡器（江苏，太仓市实验设备厂），DW-86L578J超低温冰箱（青岛海尔），高速冷冻离心机（德国 sigma，3-18K）等。

1.4 菌株的培养和悬浮液的制备 植物乳杆菌经MRS固体斜面培养基传代活化恢复活力后，接入灭菌后的MRS液体培养基中，置于37℃恒温培养箱培养12 h左右，以此作为植物乳杆菌的种子液。以1%的量再次接种入灭菌后MRS液体培养基中，使植物乳杆菌处于对数生长期后期，然后分装于50 mL无菌离心管中，置于高速冷冻离心机（10000 r/min），4 ℃离心 10 min，弃去上清液，将菌泥称重后按照1：1的比例加入灭菌生理盐水（0.9%的浓度），用小型快速振荡器快速混合均匀后，制成植物乳杆菌的菌悬液，取2 mL菌悬液进行计数（作为冻干前的活菌总数），再将剩余的菌悬液分装于无菌的10 mL冻干管中，每管2 mL菌悬液，按照试验的具体要求加入相应的冻干保护剂。

1.5 冷冻干燥 将上述制备好的菌悬液置于-20℃（或-70℃）的温度下预冻，等其完全冻结后，迅速将冻结样品移入真空冷冻干燥机中冷冻干燥24～48 h，使冻干后菌粉的含水量达3%左右，然后测定冻干后植物乳杆菌的活菌数。

1.6 菌落总数测定 参考国家标准GB 4789.35-2016乳酸菌检验方法，测定植物乳杆菌的菌落总数。存活率计算公式为：

1.7 冻干保护剂配方的选择 首先进行功能性低聚糖的单因子试验，挑选对植物乳杆菌冻干后保护效果最佳的功能性低聚糖，再选择脱脂奶粉、海藻糖和甘油，进行最优复合保护剂配方的筛选。通过设计4因素3水平的正交试验L9（34）确定最优植物乳杆菌复合保护剂配方组合。

1.8 预冻温度和预冻时间 将上述制备好的菌悬液统一加入上述筛选的最优复合保护剂后，分别置于-20℃和-70℃的低温条件下预冻2、4、6 h，将样品完全冻结后取出，然后对其进行真空冷冻干燥，最后进行活菌计数，计算出冷冻干燥后植物乳杆菌的存活率。

1.9 菌泥与水混合比例的选择 植物乳杆菌的菌泥与水的比例分别按 0.25：1、0.50：1、0.75：1、1.00：1、1.25：1进行混合，统一加入上述筛选的最优复合保护剂后转入冻干管中，然后将其进行真空冷冻干燥后进行活菌计数，计算出冷冻干燥后植物乳杆菌的存活率。

2 结果与分析

2.1 功能性低聚糖单因子的试验结果 由表1可知，所选的四种功能性低聚糖均对乳酸菌冻干有较好的保护效果，起保护效果的顺序依次为：低聚木糖＞低聚果糖＞水苏糖＞低聚异麦芽糖。为达到较好的试验效果，本试验以低聚木糖作为研究对象，对乳酸菌冻干保护剂最佳配方的选择。

表1 功能性低聚糖单因子的试验结果

2.2 正交试验设计优化复合保护剂 脱脂奶粉是一种冻干效果较好的大分子物质，在冷冻干燥时，奶粉中的乳清蛋白能在菌体外形成蛋白膜保护层，对细胞加以保护，同时可固定冻干酶类；奶粉中其他成分也有助于提高菌体的冻干存活率（徐致远等，2006）。海藻糖是一种二糖，由两个葡萄糖构成，具有大量的自由羟基，是具有极强稳定性的非还原性双糖，玻璃化温度更高，吸湿性更低，在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，保护蛋白质分子不变性失活（张敬如等，2006）。甘油（又称丙三醇）是一种多羟基化合物，能渗透到细胞内部。在冻干过程中可部分取代水分子与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团 （或者与菌体蛋白质极性基团）形成氢键，使菌体中的大分子物质在缺水状态下仍能保持原有的功能结构，维持菌体活力（朱敖兰等，2007）。

根据文献报道和试验结果（索江华等，2015；张炎等，2015；熊涛等，2011；张英华等，2006）选择脱脂奶粉、海藻糖、甘油和低聚木糖进行正交试验优化植物乳杆菌的最佳配方组合，不同比例保护剂在冻干后对植物乳杆菌存活率的影响如表2所示。

表2 植物乳杆菌冻干保护剂筛选

通过直观极差分析法可以看出（表2），影响因素依次为 D（低聚木糖）＞A（脱脂奶粉）＞B（海藻糖）＞C（甘油），得出最佳配方组合为：A3B2C2D3，即奶粉20%，海藻糖10%，甘油2%，低聚木糖5%。2.3 最佳配方的试验验证 由于最佳的配方组合未包含在正交试验的9个试验中，为了进一步确定冻干保护及配方的试验效果，按照最佳组合A3B2C2D3，再次做了三次验证试验，每次试验两个重复，其存活率均为80%左右（表3）。

表3 最佳组合的试验验证

2.4 预冻温度和预冻时间的确定 试验选择-20、-70℃，时间为2、4 h和6 h。预冻温度及冻结时间对植物乳杆菌存活率的影响见表4。由表4的结果可以看出，预冻温度对所研究的植物乳杆菌的影响不大。随预冻时间延长，植物乳杆菌存活率缓慢上升。根据试验结果得出，预冻的最适宜条件：预冻时间6 h，预冻温度-70℃。

表4 预冻温度和预冻时间对植物乳杆菌存活率的影响

2.5 菌泥与水混合比例的确定 由表5可知，菌泥与水的混合比例对植物乳杆菌的冻干存活率也有一定影响作用。菌泥太多，水的量太少，加入保护剂后容易搅拌不均匀，影响真空冷冻干燥后产品的性状。本试验结果表明，水的含量越少，冻干后菌体的存活率最高，而且冻干时间缩短，节约能耗。但是水的量也不能加入太少，要保证冻干保护剂、菌泥和水混合均匀，建议水与菌泥最佳比例为0.5：1。

表5 水与菌泥混合比例对植物乳杆菌存活率的影响

3 讨论

功能性低聚糖（或称寡糖）因其独特的生理功能，在营养保健、疾病预防、畜牧生产养殖等方面得到广泛的应用。目前已成功开发的功能性寡糖有低聚果糖（FOS）、低聚木糖（XOS）、低聚异麦芽糖（IMO）、大豆低聚糖（SBOS）、甘露寡糖（MOS）、低聚半乳糖（GOS）、低聚异麦芽酮糖、低聚龙胆糖、低聚壳聚糖和水苏糖等（闵力等，2012）。功能性低聚糖一般不被人和动物肠道所分泌的消化酶消化，但其可以明显促进肠道有益菌的增殖，抑制肠道病原菌的繁殖，从而调节肠道微生物菌群的平衡，有益于人和动物肠道菌群的健康，最终提高机体的免疫能力。目前研究发现功能性低聚糖也会调节动物体内的脂类代谢和蛋白质代谢，同时增强动物对矿物质（如钙元素）的吸收等多种生理作用（刘红梅等，2012；朱俊玲等，2003）。功能性低聚糖具有无毒副作用、无残留、无耐药性、绿色、安全、环保和稳定性强等特点，对功能性低聚糖的深入研究和开发应用具有广阔的发展前景。

目前，关于功能性低聚糖的益菌作用研究比较广泛，但是作为益生菌冻干保护剂的研究还不是很深入，功能性低聚糖含有2～10个相同或不同的单糖，每个单糖均含有自由羟基，在冻干过程中的作用机理与甘油类似，其羟基可部分取代水分子与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团 （或者与菌体蛋白质极性基团）形成氢键，使菌体中的大分子物质在缺水状态下仍能保持原有的功能结构。Schwab等（2007）发现，低聚果糖能明显提高乳酸杆菌TMW1.106在干燥以及存储过程中的存活率，推测低聚果糖可以提高乳酸杆菌细胞膜的完整性，增加细胞膜的侧压力，最终细胞膜的流动性得到提高，导致存活率提高。功能性低聚糖通过覆盖在生物分子表面，保持了细胞表面的溶剂化和天然性质，维持在冷冻干燥状态下乳酸菌细胞中水的含量，从而适度保存和避免其不受伤害（Noori等，2017）。

微生物制剂在真空冷冻干燥之前，首先要进行预冻处理。预冻是将溶液中的自由水进行固化，使真空干燥后产品的形态不发生变化，防止在真空干燥时发生起泡、浓缩、收缩和溶质移动等不可逆的变化，减少由于温度下降引起的物质可溶性降低以及生命特性发生变化（王娜等，2011）。纯水可以在0℃固化结晶，但不同物料中的液体是含有不同溶质的水溶液，所以导致其冻结温度各不相同，将物料中水溶液完全冻结时的温度称为其共晶温度。不同物质、同一物质含水量不同，其共晶温度也随之变化。预冻温度和预冻时间也是影响整个冻干周期的重要因素，许多观点认为生物体在快速降温的过程中，细胞内冰晶的产生是细胞损伤的主要原因（Shao等，2014）。

本试验结果表明，四种低聚糖对植物乳杆菌的保护率效果依次为：低聚木糖＞低聚果糖＞水苏糖＞低聚异麦芽糖，选择低聚木糖与目前乳酸菌冻干效果比较好的脱脂奶粉、海藻糖和甘油复配，通过正交试验对其浓度进行优化，得出最佳配方组合为：奶粉20%，海藻糖10%，甘油2%，低聚木糖5%。进一步验证试验结果表明，其存活率为80%左右。对植物乳杆菌冻干工艺的研究发现，最佳的预冻温度和时间分别是-70℃，6 h；菌泥与水不同比例混合冻干后，随着水分的增加，植物乳杆菌菌的存活率缓慢下降，建议水与菌泥最佳比列为0.5：1。经过冻干保护剂和冻干条件的优化，植物乳杆菌的存活率达到80%以上。通过对植物乳杆菌的冻干保护剂和冻干工艺的优化，可以为以后植物乳杆菌的冻干研究提供理论参考。