动态高压微射流协同谷氨酰胺转氨酶复合修饰对鱼明胶凝胶特性和结构的影响

赵慧竹 林俊杰 李卓恒 陈兴朋 李承恒 杨文鸽 黄 涛 张秋婷

(1宁波大学食品与药学学院，浙江 宁波 315832；2南京师范大学食品与制药工程学院，江苏 南京 210097)

明胶是由胶原蛋白经适度水解生成的一种不含脂肪的天然高分子多肽聚合物[1]。明胶因具有良好的乳化性、起泡性、凝胶性和成膜性等物理功能特性，常作为胶凝剂、稳定剂、乳化剂和增稠剂等应用于肉制品、蛋糕、冰淇淋、啤酒和果汁等生产制作中[1]。目前，全球98.5%的商业明胶来源于哺乳动物，如猪皮、牛皮和猪骨等[2-3]。因明胶应用范围广、工业性能好，市场需求量亦不断增大。但受疯牛病、口蹄病和非洲猪瘟等哺乳动物传染病的影响，哺乳动物明胶的食用安全性备受质疑；此外，由于宗教信仰，哺乳动物明胶的应用亦受到一定的限制[3-4]。因此，开发可替代哺乳动物明胶的新型明胶原料成为明胶领域研究的热点和难点之一[1，5]。

鱼明胶因具有类似于哺乳动物明胶的物理特性，被公认为是一种潜在优良的哺乳动物明胶替代品。然而，与哺乳动物明胶相比，鱼明胶脯氨酸和羟脯氨酸含量较低，使得其无充足的羟基与水形成氢键来稳定明胶胶体的三股螺旋结构，导致其凝胶特性较差，限制了鱼明胶在食品、医药等领域的应用[6]。因此，改善鱼明胶凝胶特性是提升鱼明胶应用价值的关键。鱼明胶凝胶性的改善方法主要包括生物酶交联[7-8]、磷酸化修饰[9-10]、戊二醛交联[11]、辐照[12-13]和高压处理[14]等。其中，谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase，TG)可通过催化鱼明胶分子上的赖氨酸和谷氨酰胺生成ε-(γ-Glu)-Lys(G-L) 共价键来提高鱼明胶的凝胶特性[1，11]。然而高含量TG 修饰易导致鱼明胶分子过度交联，抑制均匀蛋白质网络结构的形成，降低鱼明胶的凝胶强度，致使其无法替代哺乳动物明胶[2]。因此，单一的修饰方法不能满足提高鱼明胶凝胶特性的市场需求，复合修饰法已成为主要的趋势。目前，有关鱼明胶的复合修饰大多是基于鱼明胶-多糖复合体系，如酶法-多糖复合法[6]、多酚-多糖复合法[1]等。

研究表明，动态高压微射流(dynamic high pressure microfluidization，DHPM)技术通过对流体进行高速剪切、高频振荡、空穴以及瞬时高压等作用，可显著改善蛋白质的大分子结构，暴露更多的可修饰位点[15-17]，有助于改善蛋白质的物理特性[18]。但有关DHPM 协同TG 复合修饰法对鱼明胶凝胶特性的研究尚鲜有报道。因此，本试验通过对比研究TG 修饰和DHPM-TG复合修饰对鱼明胶凝胶特性和胶体结构的影响，旨在确定最佳修饰方法，为高品质鱼明胶的开发提供新方法和思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鳙鱼鱼鳞(夏季)，购于宁波水产市场；TG(活力1 000 U·g-1)，泰兴市一鸣生物有限公司；戊二醛、盐酸、氢氧化钠、乙醇等试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器

M-700 型动态高压微射流均质机，美国Microfluidics 公司；CR-10 色差仪，日本MINOLTA 美能达公司；T6 新世纪紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；乌式粘度计(0.9 ～1.0 mm)，上海申谊玻璃制品有限公司；CXDC-0510 低温恒温槽，南京舜马仪器设备有限公司；TA.XT Plus 质构仪，英国Stable Micro Systems 公司；Quanta200F 环境扫描电子显微镜，美国FEI 公司；1835 型乌氏粘度计，台州市椒汇玻璃仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 鱼明胶的提取 参照Sha 等[19]的方法并略作修改。将鱼鳞清洗干净，用组织捣碎机间歇性搅打90 s，除去鱼鳞表面银白色物质，用清水洗净。按照0.5 mol·L-1盐酸∶鱼鳞＝1∶20 (v/m)进行脱钙1 h 处理[11]。脱钙结束后，用清水冲洗鱼鳞至pH 值为6.0。按脱钙鱼鳞∶蒸馏水＝1∶3(m/v)，加入蒸馏水，置于80℃水浴锅中浸提2 h。提取液经过滤、浓缩、冻干即得鱼明胶。

1.3.2 DHPM 处理鱼明胶溶液 称取冻干的鱼明胶于蒸馏水中，50℃水浴加热溶解，配制成6.67%(m/v)的鱼明胶溶液。然后，将鱼明胶溶液于100 MPa 的DHPM 处理3 次，备用。

1.3.3 TG 修饰鱼明胶 称取适量的TG(1 000 U·g-1)分别加入经DHPM 处理和未经DHPM 处理的鱼明胶溶液中，充分混匀，其中TG 浓度分别为0、0.0050%、0.0075%、0.0100%、0.0125% (m/v)。将混合溶液置于40℃水浴锅中水浴40 min，再置于沸水浴10 min 灭酶活，冷却至室温后，置于冰箱备用[2]。

1.3.4 色度测量 移取20 mL 鱼明胶溶液于小烧杯中，置于10℃恒温恒湿箱中孵化16 ～17 h，使其凝固成胶体。用色差仪测量胶体颜色，每个样品测量3 次[20]。

1.3.5 浊度测量 取300 μL 鱼明胶溶液，加入蒸馏水稀释25 倍，用紫外分光光度计于440 nm 波长处测定吸光值，以蒸馏水为空白对照调零，根据公式计算浊度[20]:

式中，Abs440为吸光值；X 为玻璃皿的厚度，mm。

1.3.6 胶融温度测定 参考Muyonga 等[21]的方法并稍作修改。将鱼明胶溶液置于螺口试管中拧紧，倒置于10℃恒温培养箱中孵化16 ～18 h。将试管置于10℃低温恒温槽中，并以0.5℃·min-1的速度升温，当试管底部有气泡溢出时，开始记录槽中温度，即为鱼明胶的胶融温度。

1.3.7 特性粘度测量 参照王淑洁[22]的方法。用0.1 mol·L-1NaCl 等比例稀释鱼明胶，取18 mL 鱼明胶溶液于乌式粘度计中，记录溶液从毛细管中流出的时间。采用哈金斯公式得样品特性粘度，测试温度为室温。

式中，ηsp为增比黏度；[η]为特性粘度，d L·g-1；k为Huggins 常数；c为鱼明胶浓度，g·mL-1；η为浓度为c的鱼明胶溶液粘度，mPa·s；ηs、ηr分别为溶剂粘度和相对粘度，mPa·s；t1、t2分别为样品流出时间和溶剂流出时间，s。

1.3.8 凝胶强度测定 参考Kaewruang 等[10]的方法。将鱼明胶溶液置于25 mL 小烧杯中，于10℃恒温培养箱中孵化16～18 h，用质构分析仪测定凝胶强度。探头直径为12.7 mm，测试速度为0.5 mm·s-1。凝胶强度表示为穿透距离达到4 mm 时的最大力(g)。

1.3.9 质构测定 参考Sow 等[23]的方法。将鱼明胶溶液倒入模具中，于10℃恒温箱孵化16～18 h，将胶体切成直径2.2 cm、高1.5 cm 的圆柱体。探头直径为47 mm，测试程序:压缩量40%，速度1.0 mm·s-1。

1.3.10 扫描电子显微镜测量 参照Huang 等[9]的方法。将鱼明胶胶体置于含2.5%戊二醛的磷酸盐缓冲液(0.2 mol·L-1，pH 值7.0)中，4℃条件下固定2 h。用蒸馏水冲洗3 次后，采用30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇进行逐级脱水。将干燥后的样品置于样品台上并用导电胶带固定，利用环境扫描电镜在低真空模式下观测胶体的凝胶网络结构。测试电压为10 kV，放大倍数为1 000×。

1.4 数据处理

每组试验重复3 次，数值均为平均值±标准差。采用SPSS 17.0 软件处理分析数据。采用AI 软件作图。

2 结果与分析

2.1 色度和透明度分析

由表1可知，随着TG 浓度的增加，DHPM-TG 修饰的鱼明胶胶体的L值和溶液的浊度呈增大趋势，TG 和DHPM-TG 修饰的鱼明胶b∗值呈降低趋势(DHPM-TG4除外)，说明TG 修饰可以改善鱼明胶的表观颜色。这可能是由于TG 催化鱼明胶分子发生交联生成大分子聚合物，改变了鱼明胶的晶体结构，影响了其表观颜色[20]。此外，在较低TG 浓度下，DHPM-TG 复合修饰的鱼明胶L值略低于TG 系列胶体，这可能是由于DHPM处理改变了鱼明胶的结构，影响了鱼明胶对光的反应特性。因此，低浓度DHPM-TG 复合修饰可以更好地改善鱼明胶的表观颜色。

表1 修饰对鱼明胶胶体(颜色、胶融温度和凝胶强度)和溶液(浊度、特性粘度)物理特性的影响Table1 Effect of modification on the physical properties (color，melting temperature and gel strength)of fish gelatin gels and fish gelatin solution (opacity and intrinsicviscosity)

2.2 特性粘度、胶融温度和凝胶强度分析

由表1可知，鱼明胶的特性粘度和胶融温度均随着TG 浓度的增加而逐渐增大。这可能是由于TG 催化明胶分子中或分子间的赖氨酸和谷氨酸形成共价键，提高了鱼明胶的分子量[24-26]，从而提高了鱼明胶的特性粘度与胶融温度。然而，凝胶强度却随着TG浓度的增加呈先增大后减小的趋势，且在TG 浓度为0.0100%时，鱼明胶的凝胶强度最大。这可能是由于TG 过度交联生成的聚合物阻碍了鱼明胶分子的聚集，弱化了凝胶网络结构的生成，导致凝胶强度降低[7，27]。与TG 系列鱼明胶相比，DHPM-TG 复合修饰的鱼明胶具有更高的特性粘度、胶融温度和凝胶强度。这可能是由于DHPM 处理的鱼明胶暴露出更多的交联位点[18]，有助于TG 催化鱼明胶中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和赖氨酸的ε-氨基之间进行酰胺基转移反应，形成ε-(γ-Glu)-Lys(G-L)异型肽键，从而增强胶体的稳定程度及其网状结构的致密性。此外，与猪皮明胶的胶融温度(30.13℃)和凝胶强度(298.67 g)相比[1]，DHPM-TG3 和DHPM-TG4 的胶体具有类似于猪皮明胶的胶融温度和凝胶强度。因此，DHPM-TG 复合修饰技术可明显改善鱼明胶的凝胶特性，可应用于生产替代哺乳动物明胶。

2.3 质构特性分析

由表2可知，所有鱼明胶胶体的硬度和咀嚼性均随着TG 浓度的增加先增大后减小，且在TG 浓度为0.0100%时达到最大。DHPM-TG1 和DHPM-TG2 鱼明胶的硬度均低于TG1 和TG2，而DHPM-TG3 和DHPM-TG4 的鱼明胶硬度均高于TG3 和TG4，表明DHPM-TG 复合修饰技术在一定程度上可增大鱼明胶的硬度。这可能是由于鱼明胶经过DHPM 处理后暴露出更多的可交联位点[18]，增大了鱼明胶的交联程度，胶体结构更加致密。此外，TG 修饰和DHPM-TG复合修饰均会改变鱼明胶胶体的粘性、弹性、凝聚力和胶黏性。因此，TG 修饰和DHPM-TG 复合修饰均可改善鱼明胶的质构特性。

表2 修饰对鱼明胶凝胶的结构特性的影响Table2 Effect of modification on the textural properties of modified fish gelatin gels

2.4 扫描电子显微镜分析

如图1所示，未修饰的鱼明胶胶体呈现较多的孔洞，随着TG 浓度的增加，胶体的网状结构更加致密。这与Jongjareonrak 等[28]发现的TG 修饰的大眼鲷鱼皮明胶具有致密的网络结构相一致。与TG 修饰的胶体相比，DHPM-TG 复合修饰的胶体结构更加致密，这与其凝胶特性分析结果相一致。表明DHPM-TG 复合修饰技术使鱼明胶胶体结构更加致密，明显提高了鱼明胶的凝胶特性。

图1 修饰的鱼明胶电镜扫描图(1 000×)Fig.1 Microstructure of modified fish gelatin (1 000×)

3 讨论

鱼明胶因具有类似于哺乳动物明胶的物理特性，被公认为是一种潜在优良的哺乳动物明胶替代品。但与哺乳动物明胶相比，鱼明胶较差的凝胶特性限制了其在食品、医药等领域的应用。因此，本研究分别采用TG 修饰和DHPM-TG 复合修饰技术对鱼明胶进行修饰，结果表明，TG 修饰和DHPM-TG 复合修饰技术均可有效提高鱼明胶的特性粘度、胶融温度、凝胶强度和硬度。

凝胶强度、胶融温度和特性粘度是评价明胶品质的重要因素[1]。TG 可催化蛋白质分子内部或分子间发生交联，生成ε-(γ-Glu)-Lys(G-L)异型肽键，提高鱼明胶的凝胶强度和胶融温度；此外，生成的高分子量聚合物，可增大溶液的密度，增加流动阻力，降低水的流动性[26，29]，从而增大鱼明胶溶液的粘度。然而，高浓度的TG 易导致蛋白质过度交联，弱化凝胶网络结构，降低鱼明胶的凝胶强度和硬度。Huang 等[2]发现鱼明胶的胶融温度随着微生物谷氨酰胺酶(microbrial transglutaminase，MTGase)浓度的增大逐渐增大，而硬度则先增大后减小。此外，与TG 胶体系列相比，DHPM-TG 系列胶体具有更高的特性粘度、胶融温度、凝胶强度和硬度，可能是由于DHPM 可以促进蛋白质结构折叠，暴露出更多的可催化位点，TG 催化鱼明胶分子间或分子内形成更多的ε-(γ-Glu)-Lys(G-L)异型肽键，胶体结构更加稳定。这与叶云花等[18]研究发现DHPM-TG 改性技术可提高大豆分离蛋白凝胶强度的结果相一致。

4 结论

本研究结果表明，随着TG 浓度的增加，鱼明胶的亮度、浊度、特性粘度、胶融温度均呈增大趋势，凝胶强度和硬度先增大后减小。与TG 系列胶体相比，DHPM-TG 胶体具有更高的特性粘度、胶融温度、凝胶强度和硬度，且DHPM-TG3 和DHPM-TG4 的胶体具有类似于猪皮明胶的胶融温度和凝胶强度。综上可知，与TG 修饰相比，DHPM-TG 复合修饰可明显提高鱼明胶的凝胶特性。但本试验仅对比分析了TG 和DHPMTG 复合修饰对鱼明胶凝胶特性的影响，有关其如何有效改善鱼明胶的内在分子机制还需进一步探究。