HPLC法测定疏肝胶囊中丹参素的含量

杨建刚，李吟平，麻纪斌，张俏

(1.陕西医药控股医药研究院有限公司，陕西 西安 710075；2.陕西中药研究所，陕西 西安 712000)

疏肝胶囊由山楂、丹参、泽泻、决明子等药材经过提取、浓缩、精制而制成的复方制剂，具有降脂护肝、改善肝脏代谢的功效，其中丹参为方中君药，现代药理研究表明，丹参对具有动脉硬化实验动物有降低肝脂的作用[1-2]。丹参中有效成分有丹参酮ⅡA、丹参素等[3-4]。丹参酮ⅡA、丹参素都可以作为本复方制剂中丹参的含量控制指标。但丹参素相对于丹参酮ⅡA更稳定，并同样具有扩张冠脉、降血脂、加强脂质代谢的作用[5]。故选用更稳定的丹参素作为复方制剂中丹参的控制指标。本研究通过对疏肝胶囊中丹参素检测方法进行验证，确保检测准确，进而保证疏肝胶囊质量可控。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

甲醇，色谱纯；甲醇、冰醋酸、盐酸、无水乙醇均为分析纯；丹参素钠(批号0752—9907，含量测定用)，中国药品生物制品鉴定所。

Waters e2695高效液相色谱仪；AG-135电子天平；Cary50紫外分光光度计；H5150D超声波。

1.2 溶液配制

1.2.1 对照品溶液的制备 称取经干燥过的丹参素钠对照品适量，至棕色量瓶中，加色谱纯甲醇溶解，定容，制成每1 mL含0.08 mg(相当于每1 mL含丹参素0.072 mg)的溶液，作为对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备 取疏肝胶囊内容物研细，精密称取2.0 g，置50 mL棕色量瓶中，加水适量，超声30 min，放冷，过滤于50 mL棕色量瓶，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

1.2.3 阴性对照溶液的制备 按疏肝胶囊处方比例及工艺参数制备缺少丹参药材的样品，按照供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。按检测丹参素的色谱条件测定，结果显示阴性对照溶液在丹参素色谱峰相应的保留时间处无色谱峰，表明疏肝胶囊样品丹参素检测杂质无干扰。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.4%醋酸溶液(5∶95)，流速1.0 mL/min，检测波长280 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。理论板数按丹参素峰计算应不低于2 000。

1.3.2 测定法 按照检测丹参素的色谱条件，分别吸取丹参素对照品溶液与疏肝胶囊供试品溶液各适量于2 mL进样瓶中，采用自动进样，进样量10 μL，记录相应色谱图，按外标法以峰面积计算样品含量。对照品和供试品高效液相色谱图见图1。

图1 标准品、供试品和阴性对照色谱图Fig.1 Standard(A)，sample(B) and negative control chromatogram A.标准品色谱图；B.供试品色谱图

2 结果与讨论

2.1 扫描波长确定

取丹参素钠对照品适量，用甲醇配制对照品溶液(0.80 mg/mL)，以甲醇为空白，进行波长扫描，最大吸收波长为280 nm。故本方法选择280 nm为丹参素钠检测波长。

2.2 流动相选择

试用了甲醇-水(50∶50)、乙腈-水(5∶95)等为流动相检测丹参素，色谱峰与相邻峰分离度<1.5，最终本方法选用甲醇-0.4%醋酸溶液(5∶95)为流动相，分离效果很好，分离度>1.5。

2.3 丹参素测定的方法学验证

2.3.1 线性关系的考察 精密称取丹参素钠对照品14.00 mg(相当于丹参素12.60 mg)，用蒸馏水溶解并定容于50 mL棕色量瓶中(丹参素0.252 mg/mL)，作为储备液。分别吸取1.0，2.0，3.0，5.0，8 mL于 10 mL 容量瓶中，用水定容，作为丹参素标准系列溶液进行高效液相检测，结果见表1。以丹参素色谱峰对应的浓度(X)为横坐标，对应峰面积(Y)为纵坐标，丹参素回归方程为Y=6.167×106X-4.337×103，相关系数r=0.999 9(n=5)。结果表明，丹参素对照品在0.025 2～0.201 6 mg/mL浓度范围，丹参素对照品浓度与峰面积之间呈现良好线性关系。

表1 丹参素线性实验Table 1 Danshensu linear test

2.3.2 精密度实验 吸取丹参素对照品溶液与疏肝胶囊供试品溶液各适量分别于2 mL进样瓶中，采用自动进样，进样量10 μL，对照品溶液和供试品溶液分别连续进样5次，记录峰面积，计算RSD值，结果见表2、表3。

表2 丹参素对照品溶液精密度Table 2 Precision of Danshensu control solution

由表2可知，丹参素钠标准溶液精密度实验良好，RSD 0.50%。

表3 疏肝胶囊供试品溶液精密度Table 3 Precision of test solution of Shugan capsule

由表3可知，疏肝胶囊供试品溶液精密度实验良好，RSD 0.94%。

2.3.3 溶液稳定性实验 吸取丹参素对照品溶液与疏肝胶囊供试品溶液各适量分别于2 mL进样瓶中，采用自动进样，进样量10 μL，对照品溶液和供试品溶液分别在0，1，2，6，12 h进样，记录峰面积，计算RSD值，结果见表4、表5。

表4 丹参素对照品溶液稳定性实验Table 4 Stability test of Danshensu control solution

由表4可知,丹参素钠标准溶液在12 h内稳定，RSD
1.06%。

表5 疏肝胶囊供试品溶液稳定性实验Table 5 Stability test of test solution of Shugan capsule

由表5可知，疏肝胶囊供试品溶液在12 h内稳定，RSD
1.52%。

2.3.4 重现性实验 取批号20190321疏肝胶囊样品，取出内容物研细，分别配制5份供试品溶液，色谱条件进行测试，记录峰面积，按照外标法计算供试品含量，结果见表6。

表6 重现性实验Table 6 Reproducibility test

由表6可知，疏肝胶囊供试品中丹参素平均含量为0.24%，RSD
1.24%，重现性良好。

2.3.5 加样回收实验 取疏肝胶囊样品(批号20190321，含量0.24%)，取出内容物，研细，配制供试品储备液，浓度0.094 4 mg/mL，精密量取疏肝胶囊储备液5 mL于10 mL棕色容量瓶中(量取6份分别于6个10 mL棕色容量瓶中)，同时分别精密加入对照品溶液(丹参素0.252 mg/mL)2 mL，加水稀释并定容。按色谱检测方法进行6次回收实验，记录峰面积，用外标法计算每份溶液丹参素总量，并分别计算每份溶液回收率，结果见表7。

表7 回收率实验结果(n=6)Table 7 Results of recovery experiment

由表7可知，丹参素含量的回收率在97.42%～101.98%之间，RSD值1.60%，回收率良好。

2.4 三批疏肝胶囊含量测定

经过方法学的验证实验，证明该方法可以用于疏肝胶囊中丹参素含量的测定，因此按色谱条件，对20181025，20190321，20190416三批成品测定，结果见表8。

表8 三批样品含量测定Table 8 Determination of three batches of samples

由表8可知，三批成品丹参素含量稳定。

3 结论

采用高效液相色谱测定疏肝胶囊中丹参素的含量，色谱柱为Kromasil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.4%醋酸溶液(5∶95)，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长为280 nm。疏肝胶囊供试品溶液在12 h内稳定。方法的检测结果准确，操作简便，重现性好，可用于疏肝胶囊中丹参素的质量控制。