不同产地丹参质量评价及指纹图谱研究

高宇明，谢艳，张亚琴，何 琴，查 琪，陈兴福，吴秀清*

(1.资阳市食品药品检验检测中心，四川 资阳 641300；2.四川农业大学，四川 成都 611130)

丹参为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈的功效，用于胸痹心痛、脘腹协痛、热痹疼痛、心烦不眠、月经不调、痛经经闭、疮疡肿痛等[1]。丹参富含多种有效成分，如丹参酮类、丹酚酸类等。近年来的研究表明，丹参及其有效成分有抗肿瘤、抗血栓、抗炎、护肝等作用[2]。

目前，以丹参为原料的中成药有100余种，丹参年需求量巨大，在四川、山东、陕西、河南、安徽等地均有广泛种植[3]。由于各地丹参种质不一，栽培管理方式不同，各地气候、土壤、环境、光照差异，导致各地所产丹参质量参差不齐[4]。关于各地丹参品质的研究已有一些报道[5]，对丹参的质量评价研究也多集中在丹参酮类、丹酚酸类含量测定[6]，以及“一测多评”方法开发[7-8]等方面。本研究收集全国主要丹参产地的栽培丹参样品，分析其浸出物、丹参酮类、丹酚酸B的含量，建立指纹图谱，进行系统聚类分析，以评价不同产地丹参的质量，为保证丹参药材质量稳定提供技术依据，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20AT液相色谱仪(配SPD-20A检测器)，MS205DU电子天平(梅特勒托利多)，HY-8型摇床(苏州威尔实验用品公司)，DZKW-4型电热恒温水浴锅(北京中兴伟业世纪仪器有限公司)，TGL-16M型离心机(长沙维尔康湘鹰离心机有限公司)，KQ-700DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)。

1.2 试剂

丹酚酸B对照品(中国食品药品检定研究院111562-201716)，丹参酮IIA对照品(中国食品药品检定研究院110766-201721)，隐丹参酮对照品(中国食品药品检定研究院110852-201807)，丹参素钠(中国食品药品检定研究院110855-201614)、迷迭香酸(中国食品药品检定研究院111871-201706)纯度均大于98%。甲醇和乙腈为色谱纯(Fisher公司)，水为注射用水，其他为分析纯。

1.3 药材

在不同产地收集的栽培丹参样品，由资阳市食品药品检验检测中心吴秀清主任中药师鉴定为丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)，具体信息见表1。

表1 不同产地丹参药材基本信息

2 样品测定方法及结果

2.1 水分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、丹参酮类、丹酚酸B含量测定

2.1.1 测定方法 参照《中国药典》(2015年版)四部通则0832项下第二法测定各样品的水分[9]；参照《中国药典》(2015年版)四部通则2201项下的水溶性浸出物测定法冷浸法测定各样品的水溶性浸出物含量；参照《中国药典》(2015年版)四部通则2201项下的醇溶性浸出物测定法热浸法以乙醇为溶剂测定醇溶性浸出物含量[10]。参照《中国药典》(2015年版)一部中丹参含量测定项下测定法测定丹参酮类(隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA三者之和)和丹酚酸B的含量[1]。

2.1.2 结果与分析 《中国药典》(2015年版)规定丹参药材水分不得过13.0%，水溶性浸出物不得少于35.0%，醇溶性浸出物不得少于15.0%，隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的总量不得少于0.25%，丹酚酸B不得少于3.0%[1]。由表2可知，5省产地的35个丹参药材水分均符合规定。浸出物和含量测定结果差异较大，水溶性浸出物含量范围为43.6%～65.6%，醇溶性浸出物含量范围为14.6%～44.8%，丹参酮类含量范围为0.180%～1.46%，丹酚酸B含量范围为3.11%～8.31%。除山东莒县库山镇1批样品丹参酮类含量未达标外，其他样品均达到药典标准；水溶性浸出物含量整体偏高，最低者43.6%，远远超过药典要求的35.0%。从各产地平均值看，四川产丹参水溶性浸出物含量最高(64.2%)，但醇溶性浸出物含量最低(15.2%)；河南产丹参醇溶性浸出物含量最高(22.2%)。丹参酮类含量以山东莒县最高，达1.46%，是药典标准的6倍；另外，山东沂水、山东诸城、陕西洛南、四川雁江丹参丹参酮类含量也较高，在1.0%及以上；从平均值看，四川最高(0.985%)，安徽最低(0.562%)。丹酚酸B含量以河南孟州最高，达8.11%；陕西洛南、河南卢氏、安徽亳州、山东莒县、山东五莲含量较低，在4.0%以下；从丹酚酸B含量平均值看，四川最高(6.96%)，山东最低(5.17%)。

表2 35批丹参药材水分、浸出物、指标成分含量结果

2.2 指纹图谱

2.2.1 检测方法 指纹图谱检测参考香港中药材标准中丹参项下高效液相指纹图谱鉴别方法[11]。取丹参素、丹酚酸B、迷迭香酸、隐丹参酮、丹参酮IIA对照品适量，精密称定，加合适溶剂制成每1 mL含20 μg的溶液，作为对照品溶液。

取丹参粉末0.2 g，置50 mL离心管中，加入甲醇10 mL，超声处理30 min，离心5 min(1 200 r/min)，取上清液移入25 mL量瓶中，用水10 mL在50 mL烧杯中洗涤残渣，称定重量，用表面皿覆盖烧杯，加热至约90 ℃，浸提30 min，放冷，再称重，必要时用水补足减失的重量，滤过提取液，至同一量瓶中，加甲醇至刻度，于4 ℃左右放置过夜，用0.2 μm滤膜过滤后静置至室温，作为供试品溶液。

色谱条件：选用XselectR Hss T3 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，乙腈-(水∶乙腈∶甲酸=90∶1∶0.4)为流动相，梯度洗脱(0～40 min，0%～30%；40～50 min，30%～80%；50～70 min，80%～85%)；流速1.0 mL·min-1，检测波长280 nm，柱温：30 ℃，进样量10 μL。

2.2.2 不同产地丹参指纹图谱对照图谱生成及共有峰的指认 取“2.2.1”项下供试品溶液注入液相色谱仪分析，记录HPLC图谱，通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)》软件分析，对照图谱生成方法为“中位数”法，通过多点校正法对色谱峰进行全谱峰匹配，以S1为参照图谱，分析得到35批丹参样品的对照指纹图谱R，共得到13个共有峰(见图1)，通过对照品(见图2)指认了其中5个共有峰，分别为丹参素钠(1号峰)、迷迭香酸(3号峰)、丹酚酸B(5号峰)、隐丹参酮(10号峰)、丹参酮IIA(13号峰)。其中5号峰峰面积较大，峰形较好，选择作为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表3。

图1 丹参HPLC对照指纹图谱

注：1.丹参素钠；3.迷迭香酸；5.丹酚酸B；10.隐丹参酮；13丹参酮IIA

表3 35批丹参指纹图谱共有峰相对峰面积

2.3 35批丹参共有峰情况分析

从表4和表5可以看出，13个共有峰中峰面积RSD在27.0%～64.3%之间，指认出的5个共有峰中，5号峰丹酚酸B含量最高，峰面积RSD为27.4%，说明35批丹参中丹酚酸B含量较稳定。其他共有峰中，RSD大于50%者有6个，表明各产地样品的共有成分含量差异较大。

表4 35批丹参指纹图谱共有峰峰面积RSD

2.4 35批丹参相似度评价

利用软件计算样品图谱与对照图谱的相似性，结果见表5。从分析结果可以看出，来自5个省的35批丹参药材的相似度较高，相似度均在0.97以上，说明丹参的质量比较稳定，各地丹参成分差异不大。比较各样品的相似度，在0.99以下的有3批，2批为河南卢氏县产、1批为山东莒县产，说明该3批丹参较其他丹参者有一定特殊性。结合产地调研情况分析，这可能与卢氏县某些种植户种植丹参有两年采收的习惯有关。

3 讨论

3.1 丹参质量总体评价

表5 35批丹参相似度

从含量测定和指纹图谱结果看，丹参质量较好，基本都能满足药典规定的要求，且各地产丹参化学成分差异不大，丹参整体质量水平较高，这与有关报道的结论一致[12]。但浸出物含量方面，各地丹参差异明显，尤其是不同产地的脂溶性浸出物含量相差3倍左右。

3.2 各地丹参质量比较

四川和山东为两大丹参道地产区。山东丹参的核心产区为库山地区，有文献报道库山丹参中丹参酮类含量较低[13]。本次研究从库山地区采集的3个样本中，丹参酮类含量分别为0.74%、0.74%、0.18%，均低于山东省平均值0.93%，与文献报道一致。同时，库山附近的旗山丹参酮类含量最高(1.46%)，这可能与丹参连作，产区向周边转移后，新的产区土壤环境较适合丹参酮类聚集有关。四川雁江为近几年丹参的新产地，本次研究采集的2个样品含量测定结果显示，其水溶性浸出物、丹参酮类、丹酚酸B含量均较高，质量较好。

目前研究表明，丹参中的脂溶性有效成分合计多达50余种[14]，在抗炎、抗肿瘤、抗心血管疾病方面有较高活性[15]。故下一步可对不同产区丹参的脂溶性成分差异开展深入研究。