HPLC法测定灯盏花素葡萄糖注射液中5-羟甲基糠醛的含量及限度修订

吴均成

(广州市药品检验所，广东 广州 510160)

灯盏花素葡萄糖注射液是用于治疗缺血性脑血管疾病，如脑梗塞、脑出血后遗症所致偏瘫、冠心病、心绞痛、心肌梗塞及高黏血症等和其他缺血性及伴有微循环障碍性疾病。目前仅国家食品药品监督管理局国家药品标准WS-10001-(HD-1480)-2003收载此品种。5-羟甲基糠醛为葡萄糖或果糖脱水生成的化学物质，该物质对人体有害。本品为大输液，且葡萄糖含量较大，出于安全考虑，需检测样品中5-羟甲基糠醛的含量。通过查阅相关资料和实验考察，最终建立了高效液相色谱法，方法考察具体如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪、Chemstation色谱工作站(美国安捷伦科技有限公司)；紫外分光光度计(日立U3900)。

1.2 试剂及样品

甲醇(默克色谱纯)、水(超纯水)；冰醋酸；灯盏花素葡萄糖注射液(A厂，规格：250 mL，批号：20180301、20180302、20180303)、5-羟甲基糠醛对照品(中检院)、5-羟甲基糠醛对照品(西亚试剂)；葡萄糖阴性对照溶液(企业提供)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

照高效液相色谱法(中国药典2015年版通则0512)试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(规格250 mm×4.6 mm，5 μm)；以0.5%冰醋酸为流动相A，甲醇为流动相B，检测波长284 nm，柱温为40 ℃，进样量20 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 系统适用性溶液的制备 取5-羟甲基糠醛对照品溶液作为系统适用性溶液。

2.2.2 灵敏度溶液的制备 精密量取对照溶液1 mL，置于20 mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为灵敏度溶液。

2.2.3 样品溶液的制备 取本品原液作为样品溶液。

2.2.4 对照品溶液的制备 取5-羟甲基糠醛对照品，加水制成每1 mL中约含5-羟甲基糠醛5 μg的溶液作为对照品溶液。

2.3 系统适用性试验

取系统适用性溶液20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，5-羟甲基糠醛峰的理论塔板数符合要求，系统适用性见图1。

2.4 辅料干扰试验

5-羟甲基糠醛为葡萄糖或果糖脱水生成的产物，因此取葡萄糖阴性溶液作为辅料溶液，色谱见图2。

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2.5 耐用性试验

实验分别选择了3条不同品牌规格的C18柱，3条色谱柱均能满足系统要求，色谱见图3至图5。由于色谱柱2为短柱，主峰出峰时间过早容易与前面的辅料峰重叠，故本方法采用了色谱柱1(GL sciences Wondasil-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)进行实验。结果见表1。

表1 耐用性考察色谱参数

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2.6 线性关系考察

经试验，5-羟甲基糠醛在0.611 1～7.638 4 μg/mL浓度范围内呈线性关系，线性方程为y=125.32x+4.273 5，r=0.999 9(n=6)。

2.7 检出限与定量限

按照信噪比S/N=10计算，5-羟甲基糠醛的定量限为0.064 μg/mL，按照信噪比S/N=3计算，5-羟甲基糠醛的检测限为0.019 μg/mL。

2.8 重复性试验

取样品溶液(批号：20180301)6份分别进样，5-羟甲基糠醛峰面积的RSD为1.3%(n=6)。表明方法重复性良好。

2.9 测定结果

三批样品5-羟甲基糠醛测定结果见表2，供试品色谱见图6。

表2 5-羟甲基糠醛测定结果

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3 讨论

3.1 色谱条件选择

经查相关文献[1-8]，高效液相色谱法测定5-羟甲基糠醛的流动相有：乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸溶液、甲醇-冰醋酸溶液等流动相配型，但考虑到本品主成分在甲醇中溶解度较好且在酸中较稳定，于是拟定了以甲醇-0.5%冰醋酸(5∶95)为流动相；经二极管阵列检测器全波长扫描，5-羟甲基糠醛在284 nm波长处有最大吸收且辅料无干扰，故拟定检测波长为284 nm。

3.2 限度规定

中国药典2015年版二部收载的“葡萄糖注射液”中，测定5-羟甲基糠醛的方法为紫外-可见分光光度法，在284 nm波长处测定吸光度，吸收值不得大于0.32，此时的葡萄糖样品溶液浓度为10 mg/mL。取5-羟甲基糠醛对照品配制系列线性标准溶液，照紫外-可见分光光度法，在284 nm波长处测定吸光度，结果见表3。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得出线性方程：y=0.119 8x+0.003 2，R2=1；根据中国药典葡萄糖注射液中吸收值不得过0.32，根据线性方程得出本标准对5-羟甲基糠醛的限度浓度为2.644 4 μg/mL，即中国药典葡萄糖注射液中5-羟甲基糠醛的限度相当于其葡萄糖标示量的0.0264 44%。结合样品测定结果和出于对人体安全考虑，本方法限度设为0.01%。

表3 5-羟甲基糠醛紫外-可见分光光度法线性关系考察结果