电针智三针对血管性痴呆大鼠学习记忆及EphA4/ephrinA3蛋白表达的影响

林 吉，魏宇唯，唐中生，朱正耀，朱世杰，寇云芳，谢高宇

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

血管性痴呆(Vascular dementia,VaD)是指由缺血性卒中、出血性卒中和造成记忆、认知和行为等脑区低灌注的脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征，已经成为仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)的致精神和躯体残疾的主要因素之一，缺血性中风幸存者中有25%～30%会发展为立即或延迟的血管性认知障碍(Vascular cognitive impairment，VCI)或血管性痴呆(VaD)[1]。与AD不同，VaD是一种完全可预防、系统治疗后能有效改善症状的疾病。因此，在疾病早期有效防治VaD有重大社会意义。有研究表明，突触功能障碍在VCI和VaD的认知能力下降过程中，是造成学习记忆认知障碍的主要原因之一[2]。促红细胞生成素产生的肝细胞受体(Erythropoietin-producing hepatocellular receptor，Eph)/肝配蛋白 (Ephrin)家族蛋白是酪氨酸激酶家族的最大成员[3]，按其序列同源性及与配体亲和力可分为两个亚组：EphA和EphB，Eph家族蛋白在人体各大系统均有作用，但对于其在神经系统中的作用机制的研究最为广泛，研究显示，Eph/ephrin信号通路在神经细胞迁移、轴突导向、自动调节细胞接触、调节大脑细胞凋亡、调节脑血管生成中扮演了重要角色[4]。

研究证明，神经损伤可使大鼠海马CA1区EphA4与ephrinA3的表达明显增高，EphA4/ephrin信号通路通过调控神经元细胞参与脑缺血后的炎性损伤的过程[5]。但这一信号通路与VaD相关性尚不明确，本实验通过制备VaD大鼠模型，分析VaD大鼠海马CA1区EphA4/ephrinA3蛋白表达、血清白细胞介素-6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)含量的变化，继续探讨电针智三针改善VaD大鼠学习记忆的可能机制，以期为临床电针智三针治疗VaD提供理论依据。

1 试验材料

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠80只，体质量约300～350 g,长沙市天勤生物技术有限公司提供，许可证号:SCXK (湘) 2014-0011。

1.2 仪器

手术器械1套,华佗牌针灸针(苏州医疗用品厂，0.3 mm×40 mm)；电泳仪(Tanon，EPS-300)；超声波细胞粉碎机(宁波荣顺，RS-25S)；华佗牌SDZ-Ⅱ型电针治疗仪 (苏州医疗用品厂)；电子分析天平 (日本岛津，AUW-220D)；板式酶标仪(北京新风机电，ZS-2)；立式超低温保存箱(Haier，DW-86L386)；微孔板恒温振荡器(杭州米欧，ST70-2)；高速冷冻离心机(湘仪贝克，TGL-20M)等。

1.3 药品与试剂

尼莫地平片(亚宝药业集团股份有限公司,国药准字H14022821)；戊巴比妥钠(P3761,Sigma)；BCA蛋白定量试剂盒(康为世纪,CW0014)；一步法快速Western印迹试剂盒(康为世纪，兔CW02029、鼠CW02030)；ECL发光检测试剂盒(康为世纪，CW0049)；蛋白酶抑制剂(康为世纪，CW2200S)；蛋白印迹膜再生液(康为世纪,CW0056)；Eph A4(博奥森，bs-1455R)；Ephrin A3(博奥森,bs-6047R)；IL-6(Elabscience，E-EL-R0015c)；CRP(Elabscience，E-EL-R0022c)等。

2 方法

2.1 VaD大鼠模型制备

大鼠适应性饲养1周，术前禁食12 h，禁水4 h后开始造模。用3%戊巴比妥钠(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，将其俯卧位固定于手术台上，在第1颈椎上方纵向剪开一个小口，用镊子钝性分离肌肉，暴露出颈椎翼小孔，用直径0.5 mm电凝针插入颈椎翼小孔灼烧椎动脉1～2 s，使其永久性闭塞。24 h后，分离双侧颈总动脉，左、右颈总动脉分别不同时夹闭5 min，共夹闭3次，每次间隔10 h。假手术组除不结扎动脉外，其余操作相同。

2.2 实验动物分组

将造模成功的大鼠按照前期课题组的设计随机分组[6]：VaD模型组、尼莫地平组、电针智三针组，再配以假手术组进行比较，每组10只。

2.3 治疗方法

术后第8天开始治疗，治疗时间为每天上午9点至11点，每日治疗1次，连续治疗20天，电针智三针操作均由同一人完成。电针智三针组：使用特制的固定器固定好大鼠头部及四肢后，参照华兴邦《实验动物穴位图谱》，以百会穴作为参照，于大鼠百会穴正中前下方2 mm处取神庭穴,神庭穴两侧旁开0.5 mm处取本神穴,采用1寸毫针于皮下平刺进针0.5寸，连接电针仪，施予连续波，20 Hz,治疗20 min。尼莫地平组:按课题组之前的方法进行，每只大鼠按20 mg/(kg·d)的用量进行灌胃治疗。VaD模型组和假手术组:每只大鼠每天给予1 mL/100 g蒸馏水灌胃。

2.4 Morris水迷宫测试大鼠行为学

定位航行实验：将平台固定于第一象限，水面高于平台1 cm，水温25～27 ℃之间。第1～6天进行定位航行实验,以水迷宫四周的标志为参照物，每天分别将大鼠从平台以外的其他3个不同象限面向池壁放入水中，记录找到平台所用时间,如未在规定时间内找到平台,引导大鼠站在平台上并停留10 s记忆参照物及路线,时间记为90 s。

空间探索实验：上述实验完成后次日，撤除平台，将大鼠从第三象限放入水中，记录90 s内大鼠穿越平台区域次数。

2.5 ELISA检测血清IL-6、CRP含量

用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠,腹主动脉采血3 000 r/min离心20 min取上清，收集血清分装保存于-20 ℃冰箱备用。按照试剂盒说明书测定IL-6、CRP含量。

2.6 Western Blot检测海马CA1区EphA4/ephrinA3蛋白表达

用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，于剑突处剪开胸壁，暴露心脏，从主动脉根部用生理盐水充分灌洗，之后迅速断头取脑，于冰上剥离两侧海马。-80℃保存备用，等比例加入含蛋白抑制剂的裂解液，提取各组大鼠海马组织蛋白。取上清液用BCA法进行蛋白定量，离心收集上清;30%Acr-Bis分离胶缓冲液,10%APS TEMED混匀,制备10%分离胶,静置30～60 min静置30～60 min，上样,20 mA恒流电泳,待预染Marker条带分离清晰、间距适宜时,停止电泳。200 mA恒流,低温转膜2 h。转膜结束,使用一步法快速Western印迹试剂盒(康为世纪鼠CW2030,兔CW2029),加入封闭液中,20 min;另取二抗HRP至4 mL离心管中,再取一抗与二抗混匀,室温孵育5 min,加入一步法抗体稀释液。滴加ECL发光液显影，以β-actin为内参。

2.7 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件分析数据，结果以均数加减标准差表示，各组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间比较用 LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠空间学习能力检测结果

与假手术组相比，VaD模型组大鼠搜寻平台时间明显延长(*P<0.05，**P<0.01)，表明造模后大鼠的学习记忆能力会出现明显下降，证明VaD模型建立成功；电针智三针组和尼莫地平组寻找平台所用时间比VaD模型组明显缩短(△P<0.05，△△P<0.01),证明电针智三针能提高VaD大鼠学习能力。见表1。

表1 各组大鼠搜寻平台时间

3.2 各组大鼠空间探索能力检测结果

上述实验完成后次日，撤除平台，将大鼠从第三象限放入水中，记录到VaD模型组大鼠穿越平台象限次数明显低于假手术组(P<0.01)，说明VaD大鼠空间探索能力下降，电针智三针组穿越平台区域次数明显增加(P<0.05)，说明电针智三针能提高VaD大鼠空间记忆能力。见表2。

表2 各组大鼠穿越平台次数 次)

3.3 各组大鼠IL-6、CRP含量的变化

与假手术组比较，VaD模型组血清IL-6含量增加(P<0.05)、血清CRP含量显著增加(P<0.01)。说明造模后大鼠脑缺血会产生全身性的炎症反应。与VaD模型组比较，电针智三针组大鼠血清IL-6、CRP含量降低(P<0.05)。说明电针智三针治疗后，减轻VaD大鼠脑缺血后的炎症反应。见表3。

表3 各组大鼠血清IL-6、CRP含量

3.4 各组大鼠海马CA1区EphA4/ephrinA3含量的变化

与假手术组比较，VaD模型组海马CA1区EphA4蛋白表达增加(P<0.01)，ephrinA3蛋白表达增加(P<0.05)；与VaD模型组比较，电针智三针大鼠海马CA1区EphA4蛋白表达降低(P<0.01)；ephrinA3蛋白表达降低(P<0.05)。见图1、表4。

图1 各组大鼠海马CA1区EphA4/ephrinA3蛋白含量的表达

表4 各组大鼠海马CA1区EphA4/ephrinA3蛋白含量的表达

4 讨论

近年来，血管性痴呆(VaD)发病率正在迅速增加，在公共卫生和社会护理方面遭成了严重困扰，全世界大约有4 680万人患有痴呆症，每年有990万新增病例[7]。因此，怎样有效防治VaD成了目前痴呆和脑缺血领域的一个热点。智三针由靳瑞教授所创，其主要选取位于前额部的神庭穴和双侧的本神穴，神庭穴在左右额肌的交界处，布有额神经分支，本神穴位于额肌中，布有额神经外侧支，三个穴位正对应大脑额叶,额叶功能与记忆、判断、认知、思考、操作密切相关[8]。

脑缺血时,细胞兴奋毒性增强和能量衰竭,激发脑实质内的炎症反应，其中IL-6是一种由多种炎症细胞产生的细胞因子，能够诱导磷脂酶合成分泌，经花生四烯酸途径形成氧自由基，刺激溶酶体释放，进而加重脑组织缺血缺氧和神经损伤[9]，其效应与浓度相关，IL-6通过影响突触可塑性、神经元形态而影响认知功能。动物研究表明，脑缺血大鼠认知功能和行为改善与脑内的炎症因子IL-6水平密切相关[10]，当IL-6浓度较低时,具有神经修复的作用,提高学习记忆能力。脑内缺血损伤使细胞膜发生分离，提高了CRP的附着点，在IL-6的信息传导下，有活性的CRP随之产生[11]。CRP是判断炎性反应的重要指标之一，具有抑制炎症反应发生、发展及减轻炎症损伤的作用。正常情况下血清含量极少，当体内发生炎症时迅速释放升高，且其浓度与炎症严重程度呈正比[12]。VaD大鼠模型中，CRP升高直接导致白细胞介素 (IL-1、IL-6)和自由基的大量释放，引起血管痉挛，导致海马组织缺血、缺氧。此外，CRP分解产生的多肽可以调节免疫活性，促进局部免疫调节障碍，加重神经损伤的程度，出现认知障碍[13]。

本实验中，我们发现VaD模型组血清IL-6含量明显高于假手术组，说明炎症反应参与了脑缺血继发性损伤的过程，而电针智三针治疗后，血清IL-6含量下降，证明电针智三针的治疗减轻了VaD大鼠炎症反应，VaD大鼠的认知功能得到明显改善。也证实在VaD模型组大鼠中，血清CRP含量高于假手术组，而电针智三针治疗可以下调血清中CRP的含量，从而减轻VaD大鼠神经损伤的程度，有效改善VaD大鼠学习记忆能力。

研究发现，与其他记忆障碍疾病一样，引起VaD的认知障碍的原因之一是突触功能障碍甚至是丧失。EphA受体调节海马组织的功能和可塑性[14]。研究显示，脑缺血损伤可增加CA1区ephrinA3和EphA4蛋白的表达，EphA4可能通过肌动蛋白细胞骨架重组或黏附受体调节，并以蛋白酶体依赖性方式触发AMPA受体降解，EphA4与ephrinA3相互产生作用，其过程涉及突触修剪[15]。最新研究结果表明，抑制EphA4可以改善认知障碍小鼠模型中的社会记忆能力和认知功能，同时可观察到海马CA1区突触形态发生改变，其改变特征是树突棘长度和头部宽度增加[16]。EphA4/ephrinA3在正常成人神经系统中表达水平极低，在神经损伤及星形胶质细胞活化时表达上调，EphA4缺乏会增加神经胶质谷氨酸转运蛋白的水平，而ephrinA3会调节星形胶质细胞中的转运蛋白电流。研究表明，EphA4/ephrinA3信号传导是神经细胞调节突触功能和可塑性的关键机制[14]。本研究采用电针智三针为治疗方法，发现电针智三针组大鼠海马CA1区EphA4/ephrinA3蛋白表达较VaD组呈下降趋势，提示电针智三针能调节突触的功能可塑性，有利于改善VaD大鼠的学习和记忆能力。

本课题组早期研究证实电针智三针可能通过调节海马CA1区突触前膜EphB2和突触后膜ephrinB3表达，来改善VaD大鼠认知功能[6]。此次实验通过电针智三针对大鼠海马CA1区EphA4/ephrinA3蛋白表达的影响，从另一个角度探讨了电针智三针对VaD大鼠认知功能改善的可能机制。本实验在制备VaD大鼠的基础上，应用电针智三针干预治疗，观察不同组别大鼠血清IL-6、CRP含量的变化以及海马CA1区EphA4、ephrinA3蛋白的表达变化。结果发现：电针智三针治疗后，VaD大鼠海马CA1区EphA4、ephrinA3蛋白表达降低，同时下调了血清IL-6、CRP的含量，从而保护大鼠脑组织,减轻神经损伤程度，明显提高了VaD大鼠的认知功能。该研究为临床电针智三针治疗VaD提供了一定的理论和实验依据，至于EphA4/ephrinA3通路是通过何种途径发挥作用的，课题组还将围绕EphA4/ephrinA3通路继续探讨电针智三针改善VaD学习记忆的可能机制。