UPLC法测定大鼠血清中荜茇宁含量及变化规律

乌云索德，领 小，孟 和，昭日格图

(1.内蒙古大学 化学化工学院，内蒙古 呼和浩特 010021；2.内蒙古自治区药品检验研究院，内蒙古 呼和浩特 010010)

荜茇(Long pepper)是胡椒科植物荜茇(PiperlongumL.)的干燥近成熟或成熟果穗[1]，具有温中散寒、理气止痛的功效。现代药理学研究发现，荜茇具有显著的降血脂作用，降血脂活性成分为荜茇宁(piperlonguminine，GBN)[2-5]。药物必须进入血液循环才能产生作用，血液中药物的性质、浓度决定了其药效和毒性[6]。超高液相色谱法(UPLC)具有灵敏度高、专属性强等优点，已被广泛用于药物分析测定[7-9]。本研究采用超高效液相色谱仪建立了大鼠血清中荜茇宁的含量测定方法并观察不同给药量与血液中药物浓度的关系。该方法操作便捷、灵敏度高、选择性好，可为荜茇宁的吸收、代谢规律研究和临床合理用药提供参考依据。

1 材料与试剂

1.1 仪器

Waters Acquity UPLCTM超高效液相色谱仪(美国Waters公司，配有恒温自动进样器、二极管阵列检测器、柱温箱、Empower2色谱工作站)；MTN-2800D氮吹仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；TGL-16G冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；QL-901漩涡混合器(江苏海门市麒麟医用仪器厂)；KQ-300VDE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；EL204-IC电子天平(上海 METTLER TOLEDO仪器有限公司)；Millipore-Q Plus超纯水器(美国 Millipore公司)；RAININ 1 000 μL移液枪(上海 METTLER TOLEDO仪器有限公司)等。

1.2 材料

荜茇宁(自制，纯度>98%)；乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司)；水为超纯水；其余试剂为分析纯。

1.3 实验动物

Wistar雄性大鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(生产许可证号为SCXK(京)2012-0001)，体重为(200±20)g。

2 实验方法

2.1 对照品溶液的制备

精密称取50 mg荜茇宁，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成1 mg·mL-1的对照品储备液，置于4 ℃冰箱中保存。测定前用无水乙醇稀释得不同浓度的对照品溶液，用于制备标准曲线。

2.2 给药样品制备及给药方法

采用0.5%的CMC-Na将荜茇宁制成不同浓度的混悬液，大鼠随机分成空白组和5个给药组，5个给药组分别按照50 mg·kg-1、100 mg·kg-1、200 mg·kg-1、500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1剂量灌胃给药，每天1次，连续灌胃3 d。末次给药后0.5 h、1 h、2 h、2.30 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h取血，放置30 min，3 000 rpm离心15 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱保存备用。

2.3 血清样品处理方法

取大鼠血清500 μL，加入4倍量乙腈，涡漩混合1 min，10 000 rpm离心15 min，取上清液，氮气吹干，残渣加入250 μL乙腈，涡漩溶解30 s，过0.22 μm微孔滤膜，进行UPLC分析。

2.4 色谱条件和分析条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH shield RP18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters Corporation，USA)，流动相：乙腈-水(1∶1)，检测波长：338 nm，流速：0.4 mL·min-1；进样量：2 μL；色谱柱温度：25 ℃。

3 结果与讨论

3.1 方法专属性

取大鼠空白血清、加入荜茇宁标准品的空白血清、大鼠灌胃荜茇宁后的血清，分别按血清样品处理方法操作(“2.3”项下方法)，各样品分别取2 μL注入超高效液相色谱仪，得到UPLC色谱，见图1。由色谱图可知，荜茇宁的保留时间为1.98 min，给药血清样品色谱分离良好，血清内源性物质不干扰荜茇宁的测定。

(a)：空白血清；(b)：空白血清中加入荜茇宁；(c)：大鼠灌胃荜茇宁后血清

3.2 标准曲线及线性范围

取空白血清500 μL，加入荜茇宁标准系列溶液50 μL，配制成荜茇宁浓度为0.5、1.0、5.0、10.0、15.0 μg·mL-1的血清样品。按照“2.3”项下血清样品处理操作，取2 μL注入超高效液相色谱仪，得UPLC色谱建立标准曲线。以荜茇宁浓度为横坐标，荜茇宁峰面积为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，得到线性方程y=68.45x-52.24(r=0.999 3，加权因子为1/x)，表明血清中荜茇宁在0.5～15.0 μg·mL-1浓度范围内与峰面积积分线性关系良好(见图2)，定量限为0.5 μg·mL-1(信噪比>3)。

图2 空白血清加入系列浓度的荜茇宁后处理得到的标准曲线

3.3 精密度和准确度

取500 μL空白血清，加入适量荜茇宁标准溶液，得到低、中、高3个浓度(0.5、5.0、10.0 μg·mL-1)的质控样品各5份，测定日内及日间精密度。每天1次，连续测定5 d日间精密度(结果见表1)。实验数据表明，日内及日间精密度(RSD)均小于6%，说明该方法具有良好的精密度和准确度。

表1 大鼠血清中荜茇宁的日间和日内精密度和准确度测定 (n=5)

3.4 稳定性

分别配制低、中、高3种浓度的荜茇宁大鼠血清样品，于室温放置，每隔2 h进样分析1次，考察荜茇宁在样品测定过程中的稳定性。每一浓度进行3次分析，结果表明样品室温放置24 h稳定。

3.5 回收率

取大鼠空白血清500 μL，按照“3.2”项下方法制备低、中、高3种浓度(0.5、5.0、10.0 μg·mL-1)的质控样品，每种浓度进行5次分析。另用乙腈代替血清，按照“2.3”项下方法处理，制备相应浓度的样品，每种浓度进行5次样本分析，获得相应峰面积。结果表明回收率均大于65%，比较稳定，结果见表2。绝对回收率=测得样品浓度(C测)/理论样品浓度(C理论)。

表2 大鼠血清中荜茇宁的回收率测定 (n=5)

3.6 样品测定

将Wistar大鼠分成6个组，分别为空白组和5个给药组(灌胃给药剂量分别为50 mg·kg-1、100 mg·kg-1、200 mg·kg-1、500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1)，连续灌胃3 d，末次给药后分别于0.5 h、1 h、2 h、2.30 h、3 h、4 h、6 h、8 h和12 h取血。采血后放置30 min，在3 000 rpm条件下离心15 min，取上清液。按照“2.4”项下方法处理，获得血清样品色谱，测定血清中荜茇宁的浓度，测得药时曲线见图3。

图3 大鼠灌胃不同剂量荜茇宁后的血药浓度-时间曲线

随着灌胃剂量的增加，进入血液中荜茇宁的浓度也有增加的趋势。5个剂量以200 mg·kg-1为界限出现两种不同的情况：200 mg·kg-1以下剂量，即50 mg·kg-1、100 mg·kg-1时，第1次出现最大血药浓度的时间为1 h，第2次出现最大血药浓度的时间为3 h；200 mg·kg-1以上剂量，即500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1时，第1次出现最大血药浓度的时间为0.5 h。

4 结论

本研究结果表明，UPLC法具有灵敏度高、选择性好、前处理方法简单、回收率稳定、分析时间短(仅需5 min)的优势，适用于大鼠血清中荜茇宁的定性定量快速测定。

血药浓度和时间曲线表明，随着给药剂量的增加，大鼠血清中的荜茇宁浓度也逐渐升高。考虑到大鼠的个体差异性，灌胃给药后，随着时间的延长，荜茇宁血清浓度是以曲线的形式下降的。