龙胆多糖的果胶酶法提取工艺及抗氧化活性研究

付 晶,吕 洋,程振玉*

(1.阜新市环境监测中心站，辽宁 阜新 123000; 2.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022)

龙胆属于龙胆科植物龙胆(GentianascabraBunge)、条叶龙胆(GentianamanshuricaKitag.)、三花龙胆(GentianatrifloraPall.)的干燥根和茎，在临床实践中可用于保护人体的胃、肝、胆等器官，近年来在抗肿瘤方面也表现出了令人满意的治疗效果[1]。研究表明，多糖类物质是龙胆草最主要的活性成分之一，具有降血糖[2]、降血脂、抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、保肝[5]、免疫调节、抗病毒、抗炎等疗效。目前，常采用热水回流法[6]、微波法[7]、超声波法[8]等提取龙胆多糖。热水回流法提取温度高，且提取率较低；超声波法和微波法设备昂贵，且有可能引起糖苷键的断裂。果胶酶法可以有效破坏植物细胞壁，使植物细胞内的有效物质充分溶出，且不破坏其活性，是一种非常有前景的提取技术[9]。果胶酶法具有提取温度适中、操作方便、目标成分得率高等优点，在黄酮类、木质素、植物多糖等天然产物活性成分的提取中受到越来越多的关注。因此，作者以龙胆多糖提取率为评价指标，采用单因素实验和响应面实验优化龙胆多糖的果胶酶法提取工艺，并通过测定龙胆多糖对DPPH自由基和羟基自由基的清除率来评价其抗氧化活性，以期为工业化提取龙胆多糖奠定基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

龙胆草，市售；果胶酶，北京奥博新生物技术有限公司。

苯酚、无水乙醇、葡萄糖对照品，分析纯，天津大茂化学试剂厂；浓硫酸，分析纯，天津天医化学试剂厂。

FA2004型电子分析天平，上海精天电子仪器有限公司；DZF-6050型电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D型循环水式真空泵，巩义英峪仪器一厂；RT-08型多功能粉碎机，荣聪精密科技有限公司；722型紫外可见分光光度计，上海欣茂仪器有限公司。

1.2 龙胆多糖的提取

将干燥且粉碎的龙胆草过60目筛，准确称量1.0 g置于平底烧瓶中，加入一定质量的果胶酶和一定体积的蒸馏水，在一定温度下提取一段时间；抽滤，收集滤液，用旋转蒸发仪浓缩至少量；加入无水乙醇至体积分数为80%进行沉淀，静置过夜；抽滤，收集滤饼，用无水乙醇洗涤3次，得龙胆多糖。

1.3 龙胆多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法[9]。以葡萄糖浓度(c)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，拟合得葡萄糖标准曲线方程为：A=0.0097c-0.0057，R2=0.9995。按下式计算龙胆多糖提取率：

1.4 龙胆多糖提取工艺优化

1.4.1 单因素实验

采用单因素实验，分别考察果胶酶用量(0.01 g、0.02 g、0.03 g、0.04 g、0.05 g)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g∶mL，下同)、提取温度(35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃)、提取时间(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h)、pH值(1、2、3、4、5、6、7)对龙胆多糖提取率的影响。

1.4.2 响应面实验

在单因素实验的基础上，设计响应面实验[10-11]对影响多糖提取率的参数进一步优化，响应面实验的因素与水平见表1。

表1 响应面实验的因素与水平

1.5 龙胆多糖的抗氧化活性评价

参照文献[10]方法，测定龙胆多糖对DPPH自由基和羟基自由基的清除率，对龙胆多糖的抗氧化活性进行评价。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 果胶酶用量对龙胆多糖提取率的影响(图1)

图1 果胶酶用量对龙胆多糖提取率的影响Fig.1 Effect of pectinase dosage on extraction rate of polysaccharides from Gentiana scabra

酶用量对天然产物中活性成分的提取效果影响较大。由图1可知，当果胶酶用量由0.01 g增加到0.04 g时，龙胆多糖提取率逐渐升高；但是进一步增加果胶酶用量，提取率反而降低。因此，选择最佳的果胶酶用量为0.04 g，即4%(以龙胆草质量计)。

2.1.2 料液比对龙胆多糖提取率的影响(图2)

图2 料液比对龙胆多糖提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polysaccharides from Gentiana scabra

由图2可知，当料液比由1∶10减小到1∶40时，即提取溶剂用量由10 mL增加到40 mL，龙胆多糖提取率逐渐升高；但是进一步增加提取溶剂用量，提取率反而降低。原因可能是，提取溶剂用量较少时，一些多糖尚未溶出，导致多糖提取率较低；但当提取溶剂过多时，杂质亦会提取出来，从而抑制多糖的提取。因此，选择最佳的料液比为1∶40。

2.1.3 提取温度对龙胆多糖提取率的影响(图3)

图3 提取温度对龙胆多糖提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides from Gentiana scabra

由图3可知，当提取温度由35 ℃升至65 ℃时，龙胆多糖提取率逐渐升高；但当提取温度超过65 ℃后，多糖提取率开始下降。原因可能是，随着提取温度的升高，果胶酶的活性也随之增强，大大提高了果胶酶对细胞壁的破坏程度，利于多糖更加充分地溶出；但当提取温度过高时，会使果胶酶部分失去活性或多糖糖苷键断裂，影响多糖的溶出。因此，选择适宜的提取温度范围为55～75 ℃。

2.1.4 提取时间对龙胆多糖提取率的影响(图4)

图4 提取时间对龙胆多糖提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides from Gentiana scabra

由图4可知，在5 h内时，随着提取时间的延长，龙胆多糖提取率逐渐升高。原因可能是，随着提取时间的延长，果胶酶与龙胆草作用时间延长，从而使龙胆草的细胞壁被充分破坏，利于多糖的溶出；但当提取时间过长时，杂质亦会提取出来，从而抑制多糖的提取。因此，选择适宜的提取时间范围为4～6 h。

2.1.5 pH值对龙胆多糖提取率的影响(图5)

图5 pH值对龙胆多糖提取率的影响Fig.5 Effect of pH value on extraction rate of polysaccharides from Gentiana scabra

由图5可知，当pH值在1～2之间时，随着pH值的增大，多糖提取率逐渐升高；但当pH值超过2时，多糖提取率反而下降。因此，选择适宜的pH值范围为1～3。

2.2 响应面实验结果

2.2.1 响应面实验设计与结果(表2)

采用多元回归分析法，对表2数据进行回归拟合，得果胶酶法提取龙胆多糖工艺的二元多次回归方程为：Y=17.11-1.08A+1.09B-0.076C-0.51AB+1AC-0.29BC+0.59A2-3.28B2-2.84C2。

模型的可靠性可从方差分析及相关系数来考察。回归方程的方差分析见表3。

由表3可知，模型的F=3.86，P<0.05，表明实验所选用的二次多项模型具有显著性。在总的作用因素中， pH值、提取时间和提取温度对龙胆多糖提取率的影响均不显著；各考察因素对多糖提取率的影响不能用线性关系来表示，因素之间的交互作用影响不显著。

表2 响应面实验设计与结果

表3 方差分析

2.2.2 响应面分析

各因素交互作用对龙胆多糖提取率影响的响应面图见图6。

图6 各因素交互作用对龙胆多糖提取率影响的响应面图Fig.6 Response surface map for effect of interaction between each factor on extraction rate of polysaccharides from Gentiana scabra

由图6可知，提取时间和提取温度两个因素对龙胆多糖提取率的影响较显著，表现为曲线变化较陡，当其数值增大或减小时，龙胆多糖提取率有着较大的变化；pH值对龙胆多糖提取率的影响较小，曲线较为平滑，其数值的增大或减小对龙胆多糖提取率的影响较小。

2.2.3 验证实验

选择Design-Expert软件，结合响应面实验结果对考察因素进行优化，得到最佳工艺条件为：果胶酶用量4%(以龙胆草质量计)、料液比1∶40、提取温度62.98 ℃、提取时间5.25 h、pH值1。按优化后的最佳工艺条件进行3次验证实验，龙胆多糖提取率达到17.69%，与模型预测值(17.92%)基本一致。

2.3 龙胆多糖的抗氧化活性

2.3.1 对DPPH自由基的清除率

不同浓度的龙胆多糖溶液和VC对DPPH自由基的清除率见表4。

由表4可知，当龙胆多糖溶液浓度从0.2 mg·mL-1增加到1.0 mg·mL-1时， DPPH自由基清除率也随之升高，即清除率与龙胆多糖的浓度存在明显的量效关系。但与VC相比，龙胆多糖对DPPH自由基的清除作用较弱。

表4 DPPH自由基清除率测定结果

2.3.2 对羟基自由基的清除率

不同浓度的龙胆多糖溶液和VC对羟基自由基的清除率见表5。

表5 羟基自由基清除率测定结果

由表5可知，当龙胆多糖溶液浓度从0.2 mg·mL-1增加到1.0 mg·mL-1时，龙胆多糖对羟基自由基的清除率也随之升高，且清除率均超过50%，但较相同浓度的VC低。龙胆多糖对羟基自由基有显著的清除作用，具有较强的抗氧化能力。

3 结论

以龙胆多糖提取率为评价指标，采用单因素实验和响应面实验优化了龙胆多糖的果胶酶法提取工艺。确定果胶酶法提取龙胆多糖的最佳工艺条件为:果胶酶用量4%(以龙胆草质量计)、料液比1∶40 (g∶mL)、提取温度62.98 ℃、提取时间5.25 h、pH值1，在此条件下，龙胆多糖提取率达到17.69%。龙胆多糖具有较好的抗氧化活性，且其抗氧化活性与浓度存在一定的量效关系。该方法操作简便、绿色无污染、多糖提取率高，为龙胆多糖的工业化生产奠定了基础。