响应面法优化不同产地甘草多糖提取工艺及其抗氧化活性研究

张光辉，靳如意，张 拴，赵忠孝，韦陈彬

(陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046)

甘草又名国老、甜草，是豆科甘草属多年生的草本沙生植物，我国主要产地为新疆、内蒙古、山西、甘肃等地，常用于治疗心悸气短、咽喉肿痛及咳嗽痰多等病症[1]。甘草有效成分主要为黄酮、三萜和多糖类化合物。多糖是由众多单糖分子相互缔合而成的有机高分子化合物[2]，是生命体的重要组成部分，具有免疫调节、抗肿瘤[3]、抗病毒[4]及抗氧化作用。目前，关于甘草多糖的提取及其抗氧化活性研究均有报道。杨青青等[5]采用响应面法优化了甘草多糖浸膏提取工艺，甘草多糖提取率为12.96%。赵云生等[6]通过单因素实验和正交实验优化了乌拉尔甘草多糖的水提醇沉提取工艺，考察了粒度、温度、时间、料液比、乙醇体积分数和提取次数对乌拉尔甘草多糖提取率的影响。加列西·马那甫等[7]采用超声法对甘草籽黄酮及多糖的提取工艺进行了优化，并对其抗氧化性进行了评价，结果表明，甘草籽黄酮、多糖在水杨酸、邻二氮菲体系中对羟基自由基有一定的清除能力。乌兰其其格等[8]采用水提醇沉法提取甘草粗多糖，并利用沉淀法对提取的甘草粗多糖进行分离纯化，结果表明，加入酱油的甘草多糖试样对羟基自由基的清除能力明显增强。作者在单因素实验的基础上，以多糖提取率为响应值，以提取温度、提取时间、料液比为考察因素，采用响应面法优化甘草多糖提取工艺，并通过测定不同产地甘草多糖对DPPH自由基的清除率来评价其抗氧化活性。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

甘肃甘草、新疆甘草，陕西兴盛德中药饮片有限责任公司；内蒙古甘草，北京康美制药有限公司。

D-无水葡萄糖标准品(批号110833-201307，纯度98%)；DPPH(≥98%),上海源叶生物科技有限公司；苯酚、硫酸、石油醚、乙醇、三氯甲烷、正丁醇，分析纯。

KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器、KQ-300DE型数控超声波清洗仪，昆山超声仪器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式真空泵，郑州长城科工贸有限公司；DZTW型调温电热套，上海科恒实业发展有限公司；HX502T型电子天平，慈溪天东衡器厂；UV1102型紫外可见分光光度计，上海天美科学仪器有限公司；SJIA-10N-50A型冷冻干燥箱，宁波双嘉仪器有限公司。

1.2 甘草多糖的提取

将甘草粉碎成粗粉，用10倍体积石油醚回流脱脂3次，每次2 h，常温干燥。称取脱脂甘草粗粉20 g，置于烧杯中，在一定提取温度下按一定的料液比水提2次，过滤，滤液合并，减压浓缩，加入5倍体积无水乙醇静置12 h；过滤，沉淀用无水乙醇洗涤2次，加少量蒸馏水溶解，醇沉，抽滤，冷冻干燥，得甘草多糖粗品。称取1.0 g甘草多糖粗品，加水溶解，加入25 mL三氯甲烷、5 mL正丁醇，于37 ℃水浴恒温振荡15 min，离心，上层清液醇沉，抽滤，冷冻干燥，得甘草多糖。

1.3 标准曲线的绘制

准确称取D-无水葡萄糖标准品100 mg，加水溶解定容至100 mL容量瓶中，得浓度为1.0 mg·mL-1的葡萄糖标准溶液[9-10]。分别准确移取0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL、0.60 mL、0.70 mL、0.80 mL葡萄糖标准溶液于10 mL容量瓶中，加蒸馏水补足至2 mL，滴加5%苯酚溶液1.00 mL、浓硫酸5.00 mL，摇匀，沸水浴25 min显色，定容至10 mL，测定490 nm处吸光度[11]。以葡萄糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，拟合得线性回归方程为y=51.45x-0.0096(R2=0.9914)，表明葡萄糖浓度在20～80 μg·mL-1范围内与吸光度线性关系良好。

1.4 甘草多糖提取率的测定

采用苯酚-浓硫酸法测定甘草多糖的含量。准确称取甘草多糖25.0 mg，加水溶解定容至50 mL，摇匀。准确移取1.00 mL甘草多糖溶液，按1.3方法显色，测定490 nm处吸光度，依据线性回归方程，按式(1)计算甘草多糖提取率。

(1)

式中：c为多糖浓度，g·mL-1；V为溶液定容体积,mL；n为稀释倍数；m为甘草质量,g。

1.5 甘草多糖提取工艺优化

1.5.1 单因素实验

以甘草多糖提取率为评价指标，考察提取温度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)、提取时间(0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g∶mL，下同)对甘草多糖提取率的影响。

1.5.2 响应面实验

在单因素实验的基础上，以提取温度(X1)、提取时间(X2)和料液比(X3)为考察因素，设计3因素3水平响应面实验，因素与水平见表1。

1.6 甘草多糖的抗氧化活性

分别称取3个产地甘草多糖25.0 mg，加水溶解定容至50 mL，得0.50 mg·mL-1样品溶液。准确称取DPPH 1.0 mg，加无水乙醇溶解定容至100 mL，得0.01 mg·mL-1DPPH自由基溶液。

表1 响应面实验的因素与水平

移取2.0 mL 0.50 mg·mL-1样品溶液于棕色容量瓶中，加入1.0 mL 0.01 mg·mL-1的DPPH自由基溶液、1.0 mL无水乙醇，摇匀，暗处静置30 min[15]，测定517 nm处吸光度，按式(2)计算DPPH自由基清除率。

(2)

式中：A参为3.0 mL无水乙醇+1.0 mL DPPH自由基溶液的吸光度[16]；A样为2.0 mL样品溶液+1.0 mL DPPH自由基溶液+1.0 mL无水乙醇的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取温度对甘草多糖提取率的影响

称取0.20 g脱脂甘草粗粉5份，在提取时间为1.0 h、料液比为1∶20的条件下，考察提取温度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)对甘草多糖提取率的影响[12]，结果如图1所示。

图1 提取温度对甘草多糖提取率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction rate of Glycyrrhiza polysaccharides

由图1可知，随着提取温度的升高，多糖提取率先升高后降低，当提取温度为60 ℃时，多糖提取率最高。故选择提取温度为60 ℃。

2.1.2 提取时间对甘草多糖提取率的影响

称取0.20 g脱脂甘草粗粉5份，在提取温度为60 ℃、料液比为1∶20的条件下，考察提取时间(0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h)对甘草多糖提取率的影响，结果如图2所示。

图2 提取时间对甘草多糖提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of Glycyrrhiza polysaccharides

由图2可知，随着提取时间的延长，多糖提取率先升高后降低，当提取时间为2.0 h时，甘草多糖提取率最高。故选择提取时间为2.0 h。

2.1.3 料液比对甘草多糖提取率的影响

称取0.20 g脱脂甘草粗粉5份，在提取温度为60 ℃、提取时间为2.0 h的条件下，考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)对甘草多糖提取率的影响，结果如图3所示。

图3 料液比对甘草多糖提取率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of Glycyrrhiza polysaccharides

由图3可知，随着料液比的减小，即提取溶剂用量的增加，多糖提取率先升高后降低，当料液比为1∶30时，多糖提取率最高。故选择料液比为1∶30。

2.2 响应面实验结果

2.2.1 响应面实验设计及结果(表2)

表2 响应面实验设计及结果

对回归模型进行方差分析，结果见表3。

表3 响应面模型方差分析

2.2.2 响应面分析

根据回归方程可作出各因素交互作用对甘草多糖提取率影响的等高线图和响应面图，结果如图4所示。

由图4可知，随着提取时间的延长，甘草多糖提取率逐渐升高，在2.0 h左右达到最高；但是继续延长提取时间，甘草多糖提取率有所下降。随着提取温度的升高，甘草多糖提取率逐渐升高，且在60 ℃左右时，甘草多糖提取率达到最高；但是继续升高提取温度，甘草多糖提取率缓慢下降。随着液料比的减小，甘草多糖提取率逐渐升高，当料液比达到1∶30左右时，甘草多糖提取率达到最高，其后升幅逐渐放缓。

2.3 验证实验

通过Design-Expert 8分析，预测最佳提取工艺为：提取温度60.57 ℃、提取时间1.84 h、料液比 1∶30.92，预测甘草多糖提取率为20.24%。在此工艺下进行3次验证实验，甘肃、内蒙古、新疆甘草多糖提取率分别为(19.89±0.08)%、(11.25±0.10)%、(9.60±0.13)%。表明该提取方法稳定，工艺可行。多糖含量大小依次为：甘肃甘草>内蒙古甘草>新疆甘草。

2.4 甘草多糖的抗氧化活性

分别量取2.00 mL 0.5 mg·mL-1的甘肃、内蒙古、新疆甘草多糖提取液，按1.6方法测定DPPH自由基清除率，结果见表4。

表4 不同产地甘草多糖对DPPH自由基清除率比较/%

由表4可知，甘肃、内蒙古、新疆甘草多糖对DPPH自由基的清除率分别为27.17%、31.69%、58.68%。甘肃甘草多糖含量虽最高，但是在同浓度的情况下，新疆甘草多糖的抗氧化活性最强，说明抗氧化活性和多糖含量并没有必然联系，推测不同产地的甘草多糖结构并不相同，导致同浓度下抗氧化活性的差异。

图4 各因素交互作用对甘草多糖提取率的影响Fig.4 Effect of interaction between each factor on extraction rate of Glycyrrhiza polysaccharides

2.5 方法学考察

2.5.1 重复性实验

移取0.5 mg·mL-1甘肃甘草多糖溶液6份，按1.6方法测定吸光度，计算得DPPH自由基清除率分别为27.07%、27.10%、27.16%、27.05%、27.11%、27.13%，RSD为3.98%(n=6)。表明该方法重复性良好。

2.5.2 稳定性实验

移取0.5 mg·mL-1甘肃甘草多糖溶液1份，按1.6方法每隔10 min测定吸光度，测定6次，计算得DPPH自由基清除率分别为27.12%、27.14%、27.14%、27.15%、27.17%、27.20%， RSD为2.80%(n=6) 。表明甘肃甘草多糖溶液在60 min内稳定性良好。

2.5.2 精密度实验

移取0.5 mg·mL-1甘肃甘草多糖溶液1份，按1.6方法连续测定吸光度6次，计算得DPPH自由基清除率分别为27.11%、27.12%、27.14%、27.09%、27.11%、27.13%，RSD为1.75%(n=6) 。表明该方法精密度良好。

3 结论

在单因素实验的基础上，采用响应面法优化了甘草多糖的提取工艺，确定最佳提取工艺为：提取温度60.57 ℃、提取时间1.84 h、料液比 1∶30.92(g∶mL)，在此条件下，甘肃、内蒙古、新疆甘草多糖提取率分别为(19.89±0.08)%、(11.25±0.10)%、(9.60±0.13)%。当甘草多糖浓度为0.50 mg·mL-1时，甘肃、内蒙古、新疆甘草多糖对DPPH自由基的清除率分别为27.17%、31.69%、58.68%。抗氧化活性大小依次为：新疆甘草多糖>内蒙古甘草多糖>甘肃甘草多糖。该工艺实现了甘草多糖的高效提取，为甘草资源的开发利用奠定了一定的理论基础。