酸枣仁提取物对睡眠剥夺大鼠免疫功能的影响①

赵 翠 张 颖 王 璐 王国玉 陈 军 曲忠慧 李 伟

(承德医学院附属医院老年病科，承德 067000)

睡眠是维持生命所需的生物节律，睡眠剥夺限制了机体正常需要睡眠时间，会使机体产生疲劳感，损害学习记忆能力和降低机体免疫能力，增加糖尿病、高血压、冠心病的发病风险，甚至导致死亡。随着生活节奏加快，生活压力增加，人们趋向于不健康的生活习惯，越来越多人处于睡眠剥夺的状态[1]。研究表明，睡眠剥夺会影响免疫系统功能，包括T细胞亚群的比例和细胞因子水平等[2,3]。酸枣仁(Ziziphi Spinosae Semen)是鼠李科枣属植物干燥种子，具有宁心安神、敛汗、生津、养肝的功效，主要含有皂苷、黄酮、多糖、生物碱和脂肪酸等主要成分[4]。研究表明，酸枣仁提取物具有提高免疫力、镇静催眠的作用[5]。目前尚未发现酸枣仁提取物改善睡眠剥夺的研究报道，因此，本研究主要通过观察酸枣仁提取物对睡眠剥夺大鼠行为学、T 细胞亚群及炎症因子等免疫指标的影响，探讨酸枣仁提取物对睡眠剥夺的改善作用并阐明其保护机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 健康4周龄SD大鼠30只，雄性，体质量200～250 g，购自河北省医科大学，合格证号：SYXK(冀)2018-005。饲养温度(25±2)℃，湿度40%～60%，正常睡眠条件下适应性饲养1周，自由进食和饮水。

1.1.2药物与试剂 高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；-80℃冰箱(日本三洋公司)；流式细胞仪(山东莱索科技有限公司)；TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6 ELISA试剂盒(Biolegend公司)；中药酸枣仁购自河北省中医院。

1.2方法

1.2.1药材处理 酸枣仁粉碎后精密称取200 g，加入石油醚于60℃下加热4 h脱脂，加入70%乙醇85℃下回流除去皂苷、黄酮等成分，残渣干燥后加入蒸馏水煎煮2 h，溶液浓缩后加入95%乙醇，得到沉淀静置后3 000 r/min离心15 min，弃上清，溶于水再次加入乙醇沉淀，得到水提物，干燥后备用[6]。

1.2.2动物分组与处理 30只SD大鼠随机分为对照组、模型组、实验组，每组10只。模型组、实验组建立睡眠剥夺模型。造模后，实验组灌胃给予酸枣仁提取物7.5 g/kg(按人体60 kg计算，酸枣仁的成人日用量为25 g/kg，大鼠给药剂量为成人日用量的6倍，150 g/kg，酸枣仁提取物的生药量为50 mg/g)，1次/d，连续给药7 d。对照组与模型组灌胃给予相同剂量的生理盐水。

1.2.3动物模型的建立 参考文献[7]，采用多平台水环境法建立大鼠睡眠剥夺模型，鼠笼内设置直径6.5 cm，高8.0 cm的平台18个，平台间隔15 cm。鼠笼注水后水面低于平台1 cm，保持40 W灯光照射，大鼠放置平台上，当进入快速眼球运动睡眠时，全身骨骼肌张力明显降低，颈部肌张力降低，引起节律性低头，触水，从而无法进入快速眼球运动睡眠，连续造模4 d。

1.2.4大鼠行为学测定 实验组大鼠睡眠剥夺结束后进行旷场实验，通过水平得分与垂直得分评价各组大鼠的行为差异。80 cm×80 cm×40 cm的旷场箱，内壁涂黑色，将敞箱底面分成25个面积相等的方格，把大鼠置于旷场箱中央，观察5 min内的行为活动。水平运动得分为穿越底面方格数，穿越1格得1分，垂直得分为双足离地的直立次数，双足离地1次得1分。

1.2.5脾脏和胸腺指数的测定 给药28 d后大鼠摘眼球取血，室温放置15 min后，3 500 r/min离心5 min，取上清于-80℃冰箱保存。取血后，颈椎脱臼处死，称量大鼠体质量，无菌条件下取脾脏、胸腺称重，计算脏器指数：脾脏指数=脾脏重量(mg)/大鼠体质量(g)；胸腺指数=胸腺重量(mg)/大鼠体质量(g)。

1.2.6脾淋巴细胞增殖活性的测定 取大鼠脾脏，制备脾细胞悬液，调整浓度至1×107个/ml，加入96孔细胞培养板中，100 μl/孔，设6个复孔，其中前3孔加入100 μl ConA(5 μg/ml)，另外3孔不加ConA。置于5% CO2，37℃培养箱中培养72 h。培养结束后加入MTT(5 mg/ml)，10 μl/孔，培养结束后每孔加入100 μl 10% SDS，置摇床上低速振荡15 min，37℃静置过夜，在酶标仪570 nm波长处测量各孔的吸光度(OD值)。大鼠脾淋巴细胞的增殖能力=实验孔OD值-对照孔OD值[6]。

1.2.7NK细胞活性测定 实验前24 h传代培养靶细胞YAC-1，调整细胞浓度为2×105个/ml。取大鼠脾脏，制备脾细胞悬液，加入0.5 ml灭菌水裂解红细胞，20 s后再加入8 ml Hank′s液，1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入1 ml含10 %小牛血清的RPMI1640完全培养液，摇匀，加入1 %冰醋酸稀释，调整细胞浓度为1×107个/ml。将靶细胞加入96孔培养板，100 μl/孔，试验孔加入100 μl脾细胞(效靶比50∶1)，自然释放孔加入100 μl培养液，最大释放孔加入100 μl 2% NP40，37℃培养4 h，离心，取上清100 μl，置96孔酶标板，加入LDH基质液100 μl反应8 min，加入30 μl 1 mol/L HCl终止反应，在酶标仪492 nm波长处测定OD值。NK细胞活性(%)= (反应孔OD值-自然释放孔OD值)/(最大释放孔OD值-自然释放孔OD值)×100%。

1.2.8外周血T淋巴细胞亚群测定 取大鼠外周血0.1 ml，加入肝素抗凝，加Anti-mouse CD3 FITC、Anti-mouse CD4 APC、Anti-mouse CD8 PE，室温下避光孵育20 min，PBS洗涤3次，2 500 r/min离心5 min，弃上清，加入溶血素溶解红细胞，离心，弃上清，加入PBS 1 ml，混匀，流式细胞仪检测。

1.2.9血清炎症因子的测定 取大鼠血清，采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6水平，测定方法严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1各组大鼠旷场实验结果 与对照组相比，模型组大鼠水平运动得分和垂直运动得分均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，实验组大鼠水平运动得分和垂直运动得分均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、表1。

表1 各组大鼠旷场实验分值比较Tab.1 Comparison of field test scores of rats among various

图1 各组大鼠旷场实验分值比较Fig.1 Comparison of field tests cores among various groups

2.2各组大鼠脾脏和胸腺指数比较 与对照组相比，模型组大鼠脾脏指数和胸腺指数显著降低，与模型组相比，实验组大鼠脾脏指数和胸腺指数显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2、表2。

表2 各组大鼠脾脏指数和胸腺指数比较Tab.2 Comparison of spleen index and thymus index among various

图2 各组大鼠脾脏指数和胸腺指数比较Fig.2 Comparison of spleen index and thymus index among various groups

2.3脾淋巴细胞活性和NK细胞活性检测结果 模型组大鼠NK细胞活性和脾淋巴细胞的增殖能力明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。实验组大鼠NK细胞活性和脾淋巴细胞的增殖能力明显高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠NK细胞核脾淋巴细胞增殖活性比较Tab.3 Comparison of activity of NK cell and splenic lym-phocyte proliferation among various n=10)

2.4外周血T淋巴细胞亚群测定结果 与对照组相比，模型组大鼠CD4+T淋巴细胞比例和CD4+/CD8+T淋巴细胞比值显著降低，CD8+T淋巴细胞比例显著上升，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，实验组大鼠CD4+T淋巴细胞含量和CD4+/CD8+T淋巴细胞比值显著上升，CD8+含量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4、图3。

图3 各组大鼠T淋巴细胞亚群流式细胞图Fig.3 Flow cytometry of T lymphocyte subsets of rats among various groups

表4 各组大鼠T淋巴细胞亚群比较Tab.4 Comparison of T-lymphocyte subsets of rats among various

2.5血清TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6检测结果 与对照组相比，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6水平均显著升高(P<0.05)。与模型组相比，实验组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6水平均显著降低(P<0.05)，见表5。

表5 各组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6水平比较n=10)Tab.5 Comparison of TNF-α，IL-1β，IL-2，IL-6 of rats among various

3 讨论

睡眠是促进生长发育、形成学习记忆能力、维持生理机能必需的节律。睡眠剥夺会引起神经-内分泌-免疫调节网络的失衡，影响生理、心理功能，导致机体产生焦虑、学习记忆力下降、免疫功能失调[9]。焦虑行为对评价睡眠剥夺程度有重要意义。旷场实验被广泛地应用于评价动物的焦虑行为，其中水平得分反映行为活跃程度，垂直得分反映实验动物对新环境的好奇程度。本研究结果表明，睡眠剥夺使大鼠旷场实验的水平得分与垂直得分降低，说明大鼠睡眠-觉醒周期紊乱，兴奋性增强，认知能力下降，给予酸枣仁提取物后得到显著改善，说明酸枣仁提取物具有镇静催眠作用，能够缓和睡眠剥夺引起的情绪紧张。研究表明，酸枣仁是安神之要药，其水提物能够改善中枢CRF/CRF1R信号通路，对焦虑起抑制作用，本研究中旷场实验结果与相关文献报道一致[10]。

脾脏作为机体最大的免疫器官，是细胞免疫和体液免疫的主要发生场所，在机体免疫过程中起重要作用。T淋巴细胞是调控机体免疫反应的重要的免疫细胞，CD4+、CD8+T细胞是其重要组成部分，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值是评价机体免疫功能的重要指标[11]。Wilder-Smith等[12]研究发现，睡眠剥夺会导致T淋巴细胞亚群平衡失调，这可能与睡眠不足导致机体抗感染能力变化有关。NK细胞是原始杀伤T 细胞，具有非特异性杀伤功能，其活性能够直接反映机体细胞免疫的状态[13]。微生物产物和炎症细胞因子参与睡眠的过程，其中TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6在睡眠过程中起重要作用[14]。TNF-α是机体受到损害最先分泌的炎症细胞因子，同时诱导多种细胞炎症因子的产生，并诱发多种细胞的增殖或凋亡；IL-1β由TNF-α 诱导或由内毒素直接刺激产生[15]。CD4+T淋巴细胞由Th1细胞和Th2细胞构成，IL-2由Th1辅助细胞分泌，能提高巨噬细胞杀菌活性，具有抗肿瘤、抗感染的作用[16]。IL-6由Th2辅助细胞分泌，主要通过刺激B细胞生长和分化，参与体液免疫反应过程[17]。在睡眠过程中，TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6等细胞因子具有一定的昼夜节律性能促进睡眠。研究发现TNF-α、IL-6水平升高在患者嗜睡的发病中起重要作用，降低血浆IL-6、TNF-α水平对改善睡眠质量有重要意义[18]。

本研究结果显示，与对照组相比，模型组大鼠脾脏指数、胸腺指数、脾淋巴细胞活性和NK细胞活性显著降低，CD4+T淋巴细胞比例和CD4+/CD8+T淋巴细胞比值显著下降，CD8+T淋巴细胞比例显著升高，TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6水平均显著上升，说明睡眠剥夺导致机体免疫功能紊乱，处于应激状态，导致血清炎症因子水平升高。给予酸枣仁提取物干预后，脾脏指数、胸腺指数、脾淋巴细胞活性明显改善，T淋巴细胞亚群恢复平衡，TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6等细胞因子水平明显下降，说明酸枣仁能够调节淋巴细胞亚群平衡，抑制炎症因子释放，改善睡眠剥夺引起的免疫功能紊乱。

综上所述，酸枣仁提取物对睡眠剥夺大鼠的焦虑行为具有缓解作用，能够改善睡眠剥夺引起的免疫功能紊乱，调节T淋巴细胞亚群平衡，抑制血清TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6细胞炎症因子释放。