标记重捕技术在钉螺种群调查中的应用研究

张聪，李博，易佳，万伦，刘斯

湖北钉螺是日本血吸虫唯一的中间宿主。钉螺调查是血吸虫病防治工作的重要内容。传统的钉螺调查方法存在费时、费力、精准性不够等一系列问题[1]，因此探索和研究更加简便可行的钉螺调查方法始终是血防科研工作的核心任务之一。为此，本研究于2017年在湖北省钉螺野外实验基地采用标记重捕技术，对实验基地内沟渠中的钉螺进行标记和重捕，进而推算钉螺的种群数量。通过与传统查螺方法进行比较，探索标记重捕技术应用于野外钉螺调查并推算钉螺种群数量的可行性。

材料与方法

1 材料

实验材料包括钉螺、筛网(孔径1 mm)、指甲油(红、白、蓝、黄、绿、橙6种颜色)以及标准查螺框(33 cm×33 cm)。其中，钉螺为2014年5月自湖北省公安县采集，共40 000余只，经逸蚴法鉴定为阴性后，均匀投放到基地钉螺饲养区，使其自然生存繁殖。经2年连续观察，基地中钉螺生长情况良好，密度较高，在春秋繁殖季节可见大量幼螺，说明采自公安县的湖北钉螺能在基地中正常生长繁殖。

2 实验场所

湖北省钉螺野外实验基地建成于2014年，位于武汉市黄陂区六指街大咀村，总占地面积4 301 m2。其中钉螺养殖区占地面积3 146 m2。钉螺养殖区又分为钉螺饲养区和蓄水池区，整个饲养区被8条蓄水沟分为10块，每块饲养区约134 m2，每块区域铺设下沉式排水沟网，表层均匀铺设养殖土壤，四周采用混凝土围护。蓄水池区则向饲养区供水，保证了饲养区潮湿的环境。基地完全模拟湖北钉螺的野外生存环境，既保证了充足的阳光和水分，也具备原生态的植被环境，适合钉螺的自然生存和传代。

3 方法

3.1 标记重捕实验 在基地内选择钉螺密度较高、植被适中、沟两壁和沟底潮湿或偶有少量流水的沟渠作为实验沟渠。实验开始前在所选沟渠段的两端安装筛网(孔径1 mm)封闭实验的沟渠段，流水可以自由通过筛网。封闭的实验沟渠段成为一个相对独立的实验区，实验区外的钉螺不能进入实验区内，实验区内的钉螺不能逃逸到实验区外。选择钉螺活动相对频繁的春季和秋季开展实验，每次选择一条沟渠，用三种颜色的指甲油标记，每次实验间隔3 d，共选择6条沟渠开展实验。在春季实验中，捕获钉螺的成螺(5旋以上或>4 mm)900余只，洗净，干燥，鉴别死活并计数(剔除少量死螺，保留900只钉螺实验备用，其余均匀放回沟渠内)，用红、白、蓝三种颜色指甲油标记钉螺，每种颜色标记300只，待指甲油干燥后尽快将所有的已标记钉螺均匀地投放回整个实验沟渠中。间隔20 d后在实验沟渠中的全部范围内随机捕获钉螺成螺300只，将钉螺洗净并干燥，区分不同颜色标记的钉螺和未标记钉螺并计数，每种颜色独立计算标记个数和种群数量。同时在封闭沟渠的两端外距封闭网距离0.5、1、3、5 m处设框查螺，观察是否有逃逸的标记钉螺。秋季重复实验1次，方法与春季相同，只是改成用黄、绿、橙三种颜色指甲油标记钉螺。每次开展标记实验的同时，用传统查螺法在同一条沟渠内调查钉螺，每次调查30框，重复3次并记录相关数据。

3.2 计算公式 标记重捕实验：按照公式N=M×n/m计算种群数量(N为种群数量，M为标记个体数，n为混匀后重新捕捉的数量，m为重新捕捉个体中被标记的个体数量)[2]。分别计算春秋两季的种群数量，取3种颜色独立计算的平均值。传统查螺方法[3，4]：钉螺密度取3次结果的平均值，然后计算实验沟渠钉螺活动区域的有效面积(有效面积计算方法为：以封闭的实验沟渠长度作为长，以沟渠两边能观察到的距离水线最远处钉螺与水线的直线距离为宽，计算所得的沟渠两边的面积之和即为钉螺活动区域的有效面积)，推算该面积内的钉螺数量。

3.3 统计分析 运用SAS 9.4软件进行t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 春季实验结果

春季，在基地6条沟渠实施了标记重捕实验，每次每种颜色标记钉螺数量和重新捕捉数量均为300只，重新捕捉个体中被标记钉螺数量和计算的钉螺种群数量结果见表1；同时用传统查螺方法调查钉螺，重复3次获得的钉螺平均密度及推算的钉螺种群数量结果见表1。

2 秋季实验结果

秋季，重复春季实验，实验中改用黄、绿、橙三种颜色指甲油对钉螺进行标记，具体结果见表2。

3 与传统查螺方法的比较

实施标记重捕实验时在封闭沟渠的两端距离封闭网0.5、1、3、5 m处设框查螺，未发现有逃逸的标记钉螺。统计分析结果显示，春、秋两季中，标记重捕技术与传统调查法两者计算钉螺的种群数量差异均无统计学意义(P>0.05)。但用同一种调查方法，在春、秋两季分别计算获得的钉螺种群数量的差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

讨 论

湖北钉螺分布广，孳生环境复杂，其分布与血吸虫病的流行和扩散有着密切的关系[5-8]，因此，开展钉螺调查，掌握其分布规律有着十分重要的意义。钉螺调查作为血防工作的重要内容，简便、实用的调查方法尤其关键。标记重捕技术可获得一定范围内的动物数量，它通过对一定数量的动物标记，然后放归自然环境，待标记动物和未标记动物充分混匀后，再捕获一定数量的动物，根据标记动物所占的比例计算出这个范围内的动物数量。有学者认为活动和隐匿的动物种群通过平均密度法难以计算个体的数量(密度)，然而通过标记重捕技术可以较容易和准确地得到种群的数量[9]。钉螺作为一种隐匿的动物，我们推测其适用于标记重捕技术。辜学广等在20世纪80年代曾使用标记重捕技术研究钉螺的数量，并证明通过标记重捕技术得到的钉螺数量与实际螺口数十分接近[10]。

表1 春季标记重捕法及传统查螺法实验结果

表2 秋季标记重捕法及传统查螺法实验结果

表3 春秋两季两种方法推算钉螺种群数量统计分析

本实验以湖北省钉螺野外实验基地为依托，采用标记重捕技术计算钉螺种群数量，并将其结果与传统查螺方法比较，评价此技术用于野外钉螺调查了解钉螺种群数量的可行性。结果显示，在基地一定区域内，此法获得的钉螺种群数量与传统查螺法相近，两种方法一致性较好，考虑到传统查螺法得到的钉螺种群数量应低于实际螺口数[11-15]，而本方法获得的数值大多略高于传统方法，故本方法计算所得的种群数量可能更接近实际螺口数。另外，传统的钉螺调查方法需耗费大量人力、物力、时间，且受人为因素影响常有漏查现象[16]。因而需要一种更加快速、准确的能替代目力搜查的钉螺调查方法。与之相比，本方法在实验条件下可获得更接近真实值的调查结果，且受人为因素影响较小。与辜学广等使用的标记方法相比，本方法使用指甲油标记，操作更加便捷，同时也避免了用放射性元素标记的潜在危险。同一沟渠内用同一种方法计算的钉螺的种群数量秋季均显著高于春季，可能是由于经过了春季繁殖期后钉螺数量明显增加的原因。关于两次捕螺的间隔时间，由于钉螺是一种活动缓慢的生物，标记和未标记钉螺混匀需要时间较长，吴子松等研究发现间隔15 d仍偏短，建议适当延长[17]，故本研究将时间间隔延长至20 d，从捕获标记钉螺的分布来看效果尚可。钉螺调查是收集数据的过程，调查的数据能否真实反映疫区的螺情非常重要，而精准的调查方法是获得高质量数据的关键。本研究结果显示，在一定条件下，标记重捕技术可作为一种推算钉螺种群数量的方法，具有不低于传统方法的准确性。

尽管实验结果显示标记重捕技术可以用于计算钉螺种群数量，但我们在实验中也发现了该方法的局限性，主要表现为：一是标记重捕技术对区域环境的要求较高，钉螺基地环境较为可控，但野外环境十分复杂，很难做到划定特定的封闭区域供实验操作，因此该方法在野外应用有一定限制。二是由于钉螺个体较小，标记较为困难，也在一定程度上限制了该方法的实际应用。另外，该方法的成本效益、重复性等问题尚有待进一步研究。