禽白血病病毒gp37基因生物信息学分析及克隆表达

张雪，曹利利，郭衍冰，董航，苑淑贤，姚新华，赵权

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林 长春 130062)

禽白血病(avian leucosis)是由禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)和禽肉瘤病病毒(avian sarcoma virus，ASV)引起的以禽类造血组织中某些细胞增生为主的肿瘤性传染病的统称[1]。该病主要通过先天感染和水平接触感染传播[2]。感染此病的鸡群或者野生禽类会出现发育不良、抵抗力下降、身体各部位生出肿瘤等症状，此病对于全球养禽业具有一定威胁[3]。该病主要宿主是鸡，在肉鸡、蛋鸡及我国地方品系鸡群中均有发生，死亡率一般为1%～2%，高发时可达20%。我国已经把禽白血病归类为二类动物疫病[4]。

ALV是直径约90 nm的C型逆转录RNA病毒。根据gp85蛋白抗原性的差异以及病毒中和、受体结合和交叉干扰等试验，将ALV分为A、B、C、D、E和J等10个亚群。ALV结构基因编码区从5′端到3′的顺序为gag-pol-env。其中env基因编码病毒的2个囊膜蛋白，gp85表面蛋白和gp37跨膜蛋白[5]。gp85编码ALV受体结合决定簇，通过与宿主细胞表面受体结合，使gp37构象发生改变，通过gp37编码的跨膜蛋白定位到细胞膜上最终使病毒与宿主的细胞膜融合[6]。由于gp85的中心区包含5个可变区簇，导致其极易发生突变[7]。因此，gp37中含有的相对保守序列很可能成为抗病毒的重要靶点，而目前我国对该基因的研究很少。为深入了解gp37结构和功能，本研究借助生物信息学的方法对gp37蛋白质的理化性质等进行分析，通过构建重组质粒，诱导gp37的原核表达并纯化其蛋白，为后续制备相应单抗、建立禽白血病诊断方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与载体

大肠杆菌DH5α感受态、BL21(DE3)感受态，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；pMD18-T质粒、pET-28a(+)载体均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 主要试剂

T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ均购自宝生物工程(大连)有限公司；2×TaqPCR MasterMIX，DNA纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒(离心柱型)均购自天根生化科技(北京)有限公司；Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒(可溶型蛋白)购自康为世纪；脱脂奶粉购自OXOID，HRP标记兔抗鸡二抗购自EARTHOX，DAB显色试剂盒购自迈新试剂。

1.3 引物的设计合成及gp37基因扩增

依据ALV-J HPRS-103株的gp37基因序列(GenBank：Z46390)设计合成了1对特异性引物。上游引物(gp37-F)：5′-AAAGAGG-ATCCATGTCGCTGAGTCGTCTCTCGCC-3′(斜体为BamHⅠ酶切位点)，下游引物(gp37-R)：5′-GCGCAAGCTT-TTACAGCTGCTCCCTAATTCTATG-3′(斜体为HindⅢ酶切位点)，目的片段大小为591 bp。以ALV JL-2株(本实验室分离)前病毒cDNA为模板，PCR 扩增gp37基因。具体反应体系：2×TaqPCR MasterMix 10 μL，gp37-F 1 μL，gp37-R 1 μL，DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段。

1.4 重组表达质粒的构建及鉴定

将回收的PCR产物取5 μL与0.5 μL pMD18-T 质粒、4.5 μL酶溶液Ⅰ置于1.5 mL离心管中连接，4 ℃过夜。转化至DH5α感受态，构建克隆载体pMD-gp37。应用质粒小提试剂盒(离心柱型)提取质粒，经gp37-F/gp37-R为引物及限制性内切酶BamHⅠ/HindⅢ分别进行PCR及双酶切鉴定并测序。将测序正确的pMD-gp37及pET-28a(+)用BamHⅠ/HindⅢ进行双酶切，T4 DNA连接酶连接酶切后的目的片段及载体，转化感受态细胞BL21(DE3)中，构建重组表达载体pET-gp37。提取质粒后进行PCR 鉴定和酶切鉴定。

1.5 序列分析

选取13株不同分型禽白血病病毒毒株gp37基因(表1)，通过DNAman软件，经BLAST进行进化分析。将测序结果通过生物信息学软件对该序列的编码蛋白质的理化性质、信号肽，亲/疏水性等进行分析。

表1 13株不同分型禽白血病病毒毒株信息

1.6 目的基因的诱导表达及鉴定

1.6.1 SDS-PAGE鉴定

分别接种10 μL鉴定为阳性的pET-gp37重组菌及pET-28a(+)对照菌至5 mL含有Kan(30 μg/mL)抗性的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜。再按照1∶100分别接种至新的100 mL含有 Kan(30 μg/mL)抗性的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养1.5～2 h，至OD600达到0.6，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，37 ℃振荡培养4 h。分别吸出1 mL置于1.5 mL离心管12 000 r/min离心1 min，弃上清。加入40 μL蒸馏水及10 μL 5×蛋白上样缓冲剂混匀。沸水中浴10 min，12 000 r/min离心5 min，进行SDS-PAGE鉴定。另吸出4 mL重组菌，8 000 r/min离心5 min，弃上清，再加入1 mL PBS混匀，冰浴超声破碎菌体，分离沉淀和上清。取40 μL上清加10 μL 5×蛋白上样缓冲剂，混匀；取40 μL蒸馏水及10 μL 5×蛋白上样缓冲剂加入沉淀，混匀。将上述2管样品沸水浴中煮10 min，12 000 r/min离心5 min，进行SDS-PAGE鉴定其表达形式。

1.6.2 Western blot鉴定

将诱导表达后pET-gp37重组菌及pET-28a(+)对照菌进行SDS-PAGE鉴定。通过转膜仪将凝胶中蛋白质转至聚偏二氟乙烯膜上。5%脱脂奶粉的缓冲液中封闭。以J型ALV阳性鸡血清为一抗，HRP标记兔抗鸡为二抗进行孵育。最后应用DAB显色试剂进行显色。

1.7 表达产物的纯化及鉴定

将诱导表达的pET-gp37重组菌，8 000 r/min离心5 min，弃上清，加入10 mL结合缓冲液, 冰浴超声波裂解菌体。12 000 r/min离心10 min，收集上清。应用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒(可溶型蛋白)纯化后进行SDS-PAGE鉴定。

2 结果与分析

2.1 gp37基因的扩增与克隆载体鉴定

将PCR扩增产物，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在约591 bp处有1条清晰的条带，与预期目的条带大小一致，如图1。将获得的gp37目的基因连接至pMD-18-T载体，构建成克隆载体质粒pMD-gp37，通过PCR及双酶切鉴定，结果如图2 所示，在约591 bp处均有目的片段条带。

M.DL2000 DNA Marker；1.目的片段

M.DL2000 DNA Marker；1.PCR鉴定；2.双酶切；3.pMD-gp37质粒对照

2.2 序列分析

2.2.1 同源性分析

测序结果显示，ALV JL-2株gp37基因含有591个核苷酸，编码197个氨基酸。与HPRS-103株通过BLAST进行比对表明，核苷酸序列同源性为98.82%，氨基酸序列同源性为96.95%，二者位于同一进化分支(图3)。

•本试验研究毒株

2.2.2 gp37蛋白理化性质分析

应用Prot Param 在线软件对gp37基因理化性质分析。该蛋白含有197个氨基酸，酸性氨基酸(Asp+Glu)22个，碱性氨基酸(Arg+Lys)20个，分子量22 kDa，等电点pI 6.36，分子式是C989H1572N276O278S14，原子总数3129。在280 nm处，所有半胱氨酸形成二硫键时，消光系数是23 990 mol/cm(Abs=1 g/L，1.079)，所有二硫键均打开时，消光系数是23 490 mol/cm(Abs=1 g/L，1.057)。肽段N末端是 S(Ser)时，估计在哺乳动物网织红细胞体外半衰期1.9 h，在酵母体内半衰期>20 h，在大肠杆菌体内半衰期>10 h。不稳定指数43.10，表明该蛋白在溶液中不稳定。脂溶性指数104.06，平均亲水指数0.142。

2.2.3 gp37蛋白信号肽分析

利用SignalP-5.0 对gp37蛋白信号肽进行分析，结果显示信号肽值是0.015 5，表明无信号肽。

2.2.4 亲/疏水性分析

利用ProtScale对gp37蛋白亲/疏水性分析，其中正值表示疏水性，值越大疏水性越大，负值表示亲水性，值越小亲水性越强。1.0～3.0表示高疏水性氨基酸，-3.0～-1.0表示高亲水性氨基酸。结果如图4所示，gp37蛋白有较多个疏水性氨基酸，亲/疏水性最小值是-2.067，最大值是3.489。

图4 亲/疏水性分析结果

2.3 重组表达质粒的PCR及双酶切鉴定

将构建的原核表达pET-gp37阳性质粒进行PCR及双酶切鉴定，在591 bp左右出现1条特异性条带，与预期目的片段大小相符，如图5。

M.DL2000 DNA Marker；1.pET-28a对照；2.双酶切鉴定结果；3.PCR鉴定结果

2.4 诱导表达产物及纯化蛋白的SDS-PAGE、Western blot鉴定

将重组表达菌pET-gp37经IPTG诱导表达处理后作SDS-PAGE及Western blot鉴定，均出现与目的蛋白22 kDa大小相符的条带。蛋白纯化后经IMAGE J灰度分析，纯度为98%，纯化的gp37蛋白浓度是2.7 mg/mL，如图6、图7。

M.预染蛋白质Marker Ⅲ；1.pET-28a(+)诱导表达产物；2.pET-gp37诱导表达产物；3.纯化产物

3 讨论

相对于gp85而言，gp37具有相对保守的基因序列，且其在细胞病毒融合过程中起关键作用，因此gp37可作为防治禽白血病相关研发的另一重要蛋白[8-9]。国内关于gp37蛋白鲜有报道，仅王晓伟等[10]利用昆虫杆状病毒表达系统对该基因进行了表达。本试验利用原核表达系统对gp37基因进行表达，并采用生物信息学方法对gp37基因编码产物进行分析，为揭示gp37基因的特性提供了有价值的理论依据。

以往有研究表明，蛋白质的半衰期与其稳定性相关，即半衰期长则稳定性高[11]。本研究结果显示，gp37半衰期不长，属于不稳定蛋白，且含有多个疏水性氨基酸,无信号肽属非分泌蛋白，而这些特性与其功能的发挥是否存在某种联系，值得后续研究。

大肠杆菌表达系统是目前重组蛋白表达与纯化最常用系统，拥有众多不同类型的载体，与其他表达系统相比具有遗传背景清晰、生长迅速、培养成本低、表达量高等诸多优点，至今已发展成为一种安全的基因工程实验体系，广泛应用于疫苗生产和蛋白质功能等方面的研究[12]。本研究对gp37基因进行原核表达，得到带有His标签的融合蛋白，为进一步分析gp37结构和功能，制备gp37蛋白的抗体，建立新的ALV检测方法等后续研究提供了参考。