不同类型猪肌肉组织中代谢及线粒体功能相关蛋白分析

胡悦旻，许金蔓，彭玥晗，徐磊，鞠辉明

(扬州大学兽医学院/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

猪肉是我国居民日常生活中最主要的消费肉类，与人民生活密不可分，近年来提高猪肉生产效率，优化猪肉品质是养猪业的一大目标。猪的产肉率与骨骼肌生长发育紧密相关，骨骼肌的生长是一个严格而复杂的由分子调控的过程，与众多信号转导通路、调节因子、基因有重要联系[1]。线粒体是细胞的能量提供者，与肌肉能量代谢关系紧密，相关研究显示，运动可以通过提高线粒体能量代谢，促进卫星细胞成肌分化[2-3]。不同品种的猪线粒体DNA间有着大量差异碱基，存在线粒体基因效应，影响猪肌肉组织的能量代谢[4]。本研究选取体型差异较大的3种猪，其中大白猪是引进自西方的大体型猪，生长快，瘦肉率较高，肉质较差；姜曲海猪是我国原生的地方猪种，体型较大, 肌纤维较细，瘦肉率低，肌肉脂肪含量高，肉质口感好；巴马猪是我国原产的小型猪，痩肉率高，肉质优良[5-7]。已有研究表明猪肌肉生长发育及线粒体功能和细胞色素C氧化酶调节亚基4蛋白(cytochrome coxidase 4,COX4)、解偶联蛋白2(uncoupling proteins,UCP2)、动力相关蛋白1(dynamin related protein 1,DRP1)、视神经萎缩症蛋白1(optical atrophy-1,OPA1)、帕金森蛋白(Parkin)、B淋巴细胞瘤2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,BAX)等有密切关联。本研究通过比较上述蛋白在3个不同类型猪肌肉组织中表达的差异，结合相应蛋白的主要功能分析，在基因水平探究猪体型发育、肉质差异的机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物

巴马猪来自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所试验猪场；姜曲海猪来自江苏姜曲海种猪场；大白猪来自扬州兴泰农牧科技发展有限公司。

1.2 主要试剂

DRP1(H-16)抗体、UCP2(N-19)抗体、Bcl-2(C21)抗体、COX4(G20)抗体、BAX(△21)抗体、GAPDH(I-19)抗体均购自Santa Cruz公司；Parkin(ab233434)抗体购自Abcam公司；OPA1(nb110-55290)抗体购自NOVUS公司。

1.3 方法

1.3.1 肌肉组织总蛋白的提取

分别选取3头40日龄巴马母猪(体重分别为3.2、3.4、3.1 kg)、40日龄姜曲海母猪(体重分别为8.5、7.0、7.0 kg)、40日龄大白猪母猪(体重分别为5.1、5.8、6.8 kg)，采集3～4肋间肌肉组织，提取组织总蛋白，提取方法参考文献[8-9]。

1.3.2 Western blot 测定蛋白的相对表达量

提取的每份蛋白测定浓度后，每个品种3头猪的蛋白等质量进行混合，每个混合蛋白4个重复，每孔上样15 μg样品，每种猪做4个重复，SDS-PAGE检测 90 V转膜后，2% BSA振荡封闭30 min，孵育一抗和二抗，其中Western blot步骤详见文献[10]。用Analysis软件测定杂交条带灰度值，目标蛋白灰度值和相应内参GAPDH条带灰度值的比值为各目的条带的相对表达量，各个检测蛋白都以巴马猪中相对表达量作为基准值1.00。

1.4 数据统计与分析

采用 SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，LSD 法检验组间差异，P<0.05 为差异显著，P<0.01为差异极显著。数据用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 巴马猪、姜曲海猪和大白猪肌肉组织中线粒体功能相关蛋白的检测

应用Western blot检测巴马猪、姜曲海猪和大白猪肌肉组织中与线粒体功能相关蛋白的结果见图1，各蛋白相对表达量分析见图2。结果表明COX4、OPA1、UCP2、DRP1蛋白在大白猪中的相对表达量最高，极显著高于姜曲海猪和巴马猪(P<0.01)，在巴马猪中的相对表达量极显著高于姜曲海猪(P<0.01)。

图1 Western blot 检测与线粒体功能相关蛋白的表达

相同蛋白不同品种间，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。下同

2.2 巴马猪、姜曲海猪和大白猪肌肉组织中能量代谢相关蛋白的检测

3种猪肌肉组织中与能量代谢相关蛋白的相对表达量分析见图3、图4。BAX蛋白在巴马猪和大白猪肌肉组织中极显著高于姜曲海猪(P<0.01)。Bcl-2蛋白在大白猪中的相对表达量最高，极显著高于姜曲海猪和巴马猪(P<0.01)，在姜曲海猪中的相对表达量极显著高于巴马猪(P<0.01)。Bcl-2/BAX的相对表达量间的比值在姜曲海猪肌肉组织中极显著高于巴马猪和大白猪(P<0.01)，在大白猪中显著高于姜曲海猪(P<0.05)。Parkin蛋白在大白猪中表达量极显著高于巴马猪和姜曲海猪(P<0.01)，在巴马猪中极显著高于姜曲海猪(P<0.01)。

图3 Western blot检测与能量代谢相关蛋白的表达

图4 能量代谢相关蛋白在3种猪骨骼肌组织中相对表达量分析

3 讨论

家猪是我国最重要的肉用养殖动物，提高猪胴体净肉率、优化猪肉品质是近年来养猪业的重要发展方向。已有研究结果表明，肌肉组织中存在多个调控能量代谢及线粒体功能相关的基因，是机体的能量工厂，线粒体基因表达的差异会对肌肉组织细胞的生长和凋亡产生影响，继而影响肌肉组织的发育[11]。此前有研究通过对巴马猪和大白猪不同组织中的斯钙素-1(STC-1)及部分线粒体相关蛋白的分布进行比较，发现在2个品种猪中部分基因存在显著差异，推测猪线粒体功能可能与生长发育差异有关[10]。本研究在分析已有的研究基础上，选取部分影响线粒体功能及肌肉组织代谢相关蛋白，首次在3种不同类型猪肌肉组织中进行比较检测。

本研究首先检测了肌肉组织中线粒体功能相关蛋白COX4、OPA1、DRP1、UCP2表达量的差异。其中COX4是在ATP合成过程中起到关键作用的线粒体内膜蛋白，COX4表达的提高和线粒体功能的增强相关[12-14]；DRP1存在于胞浆和线粒体外膜，是与线粒体分裂有关的蛋白，能使其分裂成许多小线粒体，DRP1表达水平高意味着线粒体功能活性强[15]；OPA1是位于线粒体内膜上线粒体塑形蛋白，介导线粒体内膜的融合，进而促进线粒体生物学活性[16]；UCP2是线粒体外膜上的蛋白，可以抑制活性氧的生成，减少线粒体受到的损伤，对细胞起到保护作用，此外UCP2有通过降低氧化应激来调节脂质在体内代谢的功能[17-18]。上述蛋白具有保护或促进线粒体功能，表达升高说明线粒体功能强。本研究中大白猪肌肉组织中上述蛋白表达量最高，可能与其是瘦肉型猪有关。肌纤维中线粒体功能和数量显著高于脂肪组织，而上述蛋白均促进线粒体功能，因此在动物机体中促进肌肉生成、减少脂肪生成。

本研究还检测了3种不同品种猪肌肉组织中能量代谢相关蛋白Bcl-2、Parkin、BAX的差异。Bcl-2蛋白有明确的抗细胞凋亡作用，它的高表达可能通过促进细胞增殖而增快猪的新陈代谢和生长速度。BAX是Bcl家族的一员，是重要的促凋亡因子，Bcl-2可以与BAX结合形成异二聚体Bcl-2/BAX，在抑制细胞的凋亡上更具有生物学意义。通常Bcl-2/BAX的比值越大，其抗凋亡能力越强，能量代谢效率也较高[19-20]。本研究中发现Bcl-2/BAX的比值在姜曲海猪和大白猪肌肉组织中相对表达量较高，显著高于巴马猪，这说明Bcl-2/BAX可能通过提高能量利用进而促进生长速度。Parkin是与线粒体自噬相关的蛋白，通过同种途径抑制线粒体受损，促进脂肪酸代谢，减少脂肪生成[21-22]。本研究发现Parkin蛋白在瘦肉型猪巴马猪和大白猪中均极显著高于脂肪型姜曲海猪，说明该蛋白可能和猪的肉质类型相关。

综上，在3种不同体型猪中，与线粒体功能和能量代谢相关蛋白在不同品种猪肌肉组织中表达的差异较好地解释了猪种肉质类型和体型的差异，本文为进一步研究不同品种家猪体型及肉质的差异机制提供了参考。