HPLC法测定清热解毒口服液中哈巴俄苷的含量*

毛群芳，钟湘云，褚思思，邱艳明，刘颖新

(湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 412000)

清热解毒口服液是由石膏、金银花、玄参、地黄、连翘、栀子、黄芩等12味中药组成的复方制剂，具有清热解毒的功效。用于热毒壅盛所致的发热面赤、烦躁口渴、喉咙肿痛；流感、上呼吸道感染见上述证候者[1]。现行质量标准为《中国药典》2015年版一部。该标准中，仅对黄芩苷进行了含量测定。但处方中成份较多，方中绿原酸、连翘苷、栀子苷等成份的含量测定早有文献报道[2-6]。而方中玄参的主成分哈巴俄苷的测定罕见报道。故本研究针对清热解毒口服液中哈巴俄苷的含量进行测定。本实验采用高效液相色谱法测定清热解毒口服液中哈巴俄苷的含量，为清热解毒口服液的质量评价提供参考依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪 器

LC-20A型高效液相色谱仪(包括二元高压输液泵、全自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器)，日本岛津公司；CPA225D型电子分析天平，德国赛多利斯；KQ-100B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；UPK-I-10T型超纯水机，成都优越科技有限公司。

1.2 试 药

清热解毒口服液(批号1902014、1902015、1902016)，辅仁药业集团有限公司；哈巴俄苷对照品(批号：C100560)，贵州迪大科技有限公司；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱：0～10 min 97%～90% B，10～20 min 90%～67% B，20～25 min 67%～60% B，25～30 min 60%～50% B，30～35 min 50%～20% B，40 min 20% B，40～42 min 20%～97% B；检测波长：278 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流速：1 mL·min-1。

2.2 溶液的制备

(1)对照品溶液的制备：精密称取哈巴俄苷对照品适量，加30%甲醇溶解并定容至刻度，制成后每mL含哈巴俄苷61.2 μg。

(2)供试品溶液的制备：精密量取清热解毒口服液5 mL，至25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容至刻度。

2.3 阴性对照试验

按照《中国药典》2015年版一部中该药的处方比例和制备方法，制成不含玄参的样品溶液，按“2.2.2”项下的方法制成阴性对照溶液。按照“2.1”项下的色谱条件，注入高效液相色谱仪。阴性对照溶液的色谱图中，在与哈巴俄苷色谱峰对应的位置上，无干扰峰出现。见图1。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.4 系统适应性试验

在“2.1”项中的色谱条件下，分别测定哈巴俄苷对照品溶液和供试品溶液，记录色谱图。哈巴俄苷色谱峰的理论板数不低于5000，分离度大于1.5。

2.5 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下的对照品溶液2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、20 μL，依次注入液相色谱仪，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，分别记录哈巴俄苷色谱峰的峰面积，并计算其含量。以哈巴俄苷含量(X，μg·mL-1)为横坐标，相应的峰面积(Y)为纵坐标，得出回归方程：Y=15508X+29816，相关系数R2=0.9999，表明哈巴俄苷在12.24～122.4 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定。结果其峰面积RSD为0.72%，表明此方法下，仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

精密量取清热解毒口服液(批号：1902014)适量，按照“2.2.2”项下方法制得供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、8、12、24 h按“2.1”项下色谱条件测定，结果其峰面积RSD为1.14%，表明供试品溶液24 h内在室温下稳定。

2.8 重复性试验

分别精密量取同一批号清热解毒口服液(批号：1902014)适量，按照“2.2.2”项下方法制得6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果其峰面积RSD为1.36%，表明此方法重复性良好。

2.9 加样回收试验

精密量取清热解毒口服液(批号：1902014)5 mL，共6份，至25 mL容量瓶中，分别精密加入一定量的对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制得供试品溶液，测定峰面积，计算回收率。平均回收率为99.52%，RSD为1.10%。

2.10 样品测定

表1 清热解毒口服液中哈巴俄苷的含量测定结果表Table 1 Determination of Harpagoside in Qingrejiedu oral liquid

取3批样品，依法制得供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定并计算哈巴俄苷的含量，结果见表1。

3 结 论

通过DAD扫描得出哈巴俄苷的最大吸收波长为278 nm，故将此波长设定为测定波长。

哈巴俄苷在结构上属于环烯醚萜苷类化合物，易溶于甲醇。查阅《中国药典》及相关文献，哈巴俄苷通常使用甲醇进行提取[7-8]。故本实验采用甲醇溶液提取制备供试品溶液。对提取溶剂的浓度进行选择时发现，用50%甲醇溶液提取样品，杂质干扰较小，哈巴俄苷含量较高。因此选用50%甲醇溶液作为样品的提取溶剂。

哈巴俄苷具有一定的酸性，流动相中加入适当比例的酸，能改变峰形，有助于哈巴俄苷与干扰峰的分离。而实验中发现，甲醇-磷酸水系统的洗脱能力相对较弱，待测峰不能获得很好的分离。故采用乙腈-磷酸水梯度洗脱系统。

本实验所建立的高效液相色谱法，操作简单，结果准确、重现性较好，可用于清热解毒口服液中哈巴俄苷的含量测定，为清热解毒口服液的质量评价提供参考依据。