河南华溪蟹nanos1、nanos2、piwi基因部分序列的克隆及表达特征

刘俊卿，孙 敏，王 兰

(山西大学生命科学学院，太原 030006)

nanos基因编码的高度保守RNA结合蛋白，最初在果蝇(Drosophilidae)中被鉴定为前后极形成所必需的翻译阻遏物，对维持生殖细胞的存活起重要作用[1]。该蛋白具有两个保守的Cys-Cys-His-Cys锌指基序(CCHC)，并且CCHC基序的每个氨基酸对于果蝇中的nanos基因功能都是必不可少的[2]。研究表明，果蝇nanos基因在介导腹部形成、原始生殖细胞(Primordial Germ Cells，PGCs)的特化和迁移以及生殖干细胞的维持等方面发挥重要作用[3,4]。此外，在人(Homosapiens)[5]、线虫(CaenorhabditisElegans)[6]、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)[7]、斑马鱼(Daniorerio)[8]、小鼠(Musmusculus)[9]、中华鲟(Acipensesinensis)[10]和中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)[11]等物种中均有nanos同源基因的报道，且在同一物种中也存在nanos基因的同源基因。但是nanos基因的功能研究目前仅局限于模式生物，甲壳动物中nanos基因及其同源基因的生物学功能鲜有报道。研究显示，nanos基因有3个同源基因，分别为nanos1、nanos2和nanos3，小鼠nanos2和nanos3基因均在原始生殖细胞和未分化的精原细胞中表达[12]。斑马鱼对于原始生殖细胞的形成和迁移以及卵母细胞的产生和维持起非常重要的作用[13]。

Yin等[14]研究发现piwi基因首次出现在果蝇卵巢中，果蝇piwi基因突变会引起生殖干细胞分裂失调，从而导致不育[15]。piwi基因编码一种高度碱性的蛋白，该蛋白具有转录和转座子沉默及翻译抑制的功能，可通过与精子发生相关的小RNA相互作用调控基因表达[16]。目前为止，甲壳动物中piwi基因仅在三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[17]、中华绒螯蟹[11]中有报道，其基因表达模式和功能仍待研究。

nanos基因是构成性腺P颗粒关键的组成成分，nanos基因缺失，导致生殖干细胞迁移的失败[18]。piwi基因参与干细胞的自我调控，在生殖干细胞的维持和生殖细胞的分化中起关键调控作用。因此，本研究选取了生殖基因nanos1、nanos2和piwi进行研究，为甲壳动物的生殖调控研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用到的河南华溪蟹均购自山西省太原市五龙口水产市场，于实验室驯养两周。挑选肢体完整、体重为(20±3)g、头胸甲长宽为(3.4±0.2)cm的雌、雄河南华溪蟹。解剖并迅速取出卵巢、精巢、副性腺、鳃、心、肝胰腺、肠、胃、肌肉等组织；将组织放入用 DEPC 水处理的冻存管中，迅速投入液氮速冻半小时以上，于-80 ℃保存。

1.2 组织总 RNA 的提取

取河南华溪蟹各组织，用 RNAiso Plus(Takara)试剂提取总RNA并溶于RNase-free水中；用微量分光光度计(Biospectrometer)和1.5%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度及纯度；检测完整的RNA用于cDNA模板的制备。

1.3 基因的克隆

根据卵巢组织转录组测序结果挑选出nanos1、nanos2、piwi基因的序列，利用Primer 5.0设计引物(表1)。以河南华溪蟹卵巢组织cDNA为模板，使用 2×Es Taq SuperMix(康为世纪)进行PCR扩增。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，49 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，循环30次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保温。三个基因的退火温度和延伸时间分别为nanos1：49 ℃，1.5 min；nanos2：50 ℃，15 s；piwi：60 ℃，2 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

表1 本试验所使用的引物序列

PCR产物经胶回收试剂盒(Sangon Biotech)回收纯化后，与克隆载体T-Vector pMD 19(Simple)(Takara)4 ℃过夜连接，经转化、挑取单克隆、测序及序列拼接后得出基因的部分cDNA片段。

1.4 nanos1、nanos2和piwi基因系统进化分析

将得到的nanos1、nanos2和piwicDNA序列使用SnapGene 软件翻译成氨基酸序列，在NCBI上进行同源检索。运用MEGA6.0软件对检索到的同源序列分别构建三个基因的NJ(Neighbor-joining方法)系统发育树[21]。

表2 河南华溪蟹Nanos和PIWI其它物种的氨基酸序列GenBank登录号

1.5 河南华溪蟹nanos1、nanos2、piwi基因在不同组织和不同发育时期卵巢中的表达分析

以rpl38基因作为内参(扩增长度为104 bp)[22]，采用半定量PCR方法检测河南华溪蟹nanos1、nanos2和piwi基因在体内不同组织和不同发育时期卵巢中的表达情况。分别以卵巢、精巢、副性腺、鳃、心、肝胰腺、肠、胃、肌肉组织cDNA为模板，和以增殖期、小生长期、大生长期、成熟期的卵巢cDNA为模板，以nanos1-F/R、nanos1-F/R、piwi-F/R和rpl38-F/R为引物，使用2×Es Taq SuperMix进行PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

2 结果

2.1 河南华溪蟹 nanos1、nanos2、piwi基因部分片段的获得

根据河南华溪蟹卵巢转录组测序结果，利用Primer 5.0设计nanos1、nanos2、piwi基因的特异引物，通过PCR扩增分别得到1 182 bp、243 bp、1 951 bp的DNA片段(图1)，经胶回收、连接、转化、挑取单克隆进行测序，测序结果经Blast比对分析，确定获得了河南华溪蟹nanos1、nanos2、piwi基因的部分cDNA序列(即基因的保守域序列的获得)。

图1 河南华溪蟹nanos1、nanos2和 piwi基因的克隆

2.2 河南华溪蟹nanos1、nanos2、PIWI氨基酸序列系统进化分析

系统进化树结果如图2显示，12个不同物种的Nanos分别聚为两个类群。河南华溪蟹nanos1与nanos2均与中华绒螯蟹亲缘关系最近，且nanos1与中华绒螯蟹聚为一支，其次为凡纳滨对虾和美洲钩虾，与湿木白蚁、白鳍豚、中国地鼠、长爪沙鼠、褐家鼠处于同一个类群；与果蝇、黑腹果蝇、斑马鱼、金鱼等处于两个类群，亲缘关系较远。图3表明，河南华溪蟹PIWI与三疣梭子蟹和斑节对虾PIWI蛋白聚为一小支，而中华绒螯蟹和鱼类PIWI单独聚为一支，说明河南华溪蟹PIWI与三疣梭子蟹和斑节对虾的同源性最高，亲缘关系最近，与中华绒螯蟹亲缘关系较远。

图2 nanos1和nanos2分子系统进化树

图3 PIWI分子系统进化树

2.3 河南华溪蟹nanos1、nanos2、piwi基因的组织特异性表达

利用SqRT-PCR检测nanos1、nanos2和piwi基因在河南华溪蟹不同组织中的表达情况(图4 A)。结果显示，nanos1基因在卵巢、精巢、鳃、心和肌肉中均有表达(图4 A和B)；nanos2基因在卵巢、精巢、副性腺、心脏、肠和肌肉中均有表达，且卵巢中表达量比精巢中表达量高，副性腺中表达量较低(图4 A和C)；piwi基因特异表达于卵巢和精巢中(图4 A和D)。由图4可知，nanos1、nanos2、piwi基因均在卵巢组织中高丰度表达。

图4 河南华溪蟹nanos1、nanos2、piwi基因的组织特异性表达和灰度分析

2.4 nanos1、nanos2、piwi基因在卵巢发育过程中的表达特征

为确定nanos1、nanos2、piwi基因在不同发育时期卵巢中[23]的表达情况，本研究利用SqRT-PCR对三个基因的表达时序进行了检测。结果如图5所示，在卵巢发育过程中nanos1基因表达量从增殖期、小生长期、大生长期到成熟期呈现出逐渐升高的趋势，在成熟期表达量最高(图5 A)；nanos2和piwi基因随着卵巢的发育表达量逐渐降低，在成熟期卵巢中表达量最低(图5 B和5 C)。

3 讨论

生殖调控基因nanos1、nanos2和piwi对于河南华溪蟹生殖细胞的发育是必不可少的。nanos1、nanos2和piwi均是母源因子，在生殖细胞中均有表达，在生殖细胞分化、迁移、生存和维持过程中起关键作用。nanos1、nanos2和piwi表达量的改变会影响PGCs的数量、分布和迁移，从而导致生殖毒性[24]。

nanos基因对生殖细胞的迁移和分化起关键调控作用，在不同物种中其同源基因存在功能的分化。研究表明，小鼠nanos1基因在胚胎、成体睾丸和脑组织中均有表达，而nanos2基因为生殖细胞所特有[25]；紫色球海胆(Strongylocentrotuspurpuratus)基因组中存在3种nanos同源基因，其中nanos1基因仅在卵巢中表达，nanos2和nanos3基因在小微丝粒(sMics)中积累[26]，尽管表达分布不同，但都对生殖细胞的迁移和分化起至关重要的作用[27]；人nanos1基因在许多组织中均有表达，但nanos2基因特异表达于卵巢和精巢[25]，且nanos1基因与pumilio基因形成了复合体，对生殖细胞发育过程中特定mRNAs的翻译抑制起着至关重要的作用。本研究结果表明，河南华溪蟹nanos1 和nanos2基因除分布于卵巢和精巢中，还分布于其它组织中，且均在卵巢中高丰度表达。与之相似，中华绒螯蟹nanos基因在卵巢、精巢、血液、肌肉、心脏、胸神经节、鳃、肝胰腺和肠中均有表达，其中血液中表达量最低，性腺中表达量最高[17]。因此，推测甲壳动物中不同的表达谱可能发挥着不同的生物学功能。

piwi基因参与干细胞的自我调控，在生殖干细胞的维持和生殖细胞的分化中起关键调控作用。研究表明，哺乳动物中piwi基因仅在精巢中特异性表达，斑马鱼piwi基因特异表达于卵巢和精巢[28]，本研究发现在直接发育的河南华溪蟹中，piwi基因也特异表达于卵巢和精巢组织。与之不同的是，在间接发育的中华绒螯蟹中，piwi基因在各组织中均有表达，其中在卵巢中的表达量最高，其次为精巢，肝胰腺的表达量最少[17]，推测piwi基因可能在甲壳动物直接发育和间接发育的调控过程中发挥不同的作用。

此外，卵巢发育时序结果表明，nanos1、nanos2和piwi基因的表达贯穿了整个河南华溪蟹的生殖发育过程，表明了它们对卵巢发育起重要调控作用，和nanos1相比nanos2，piwi基因的表达与其相反，随着卵巢的发育，表达量逐渐降低，这种现象可能与河南华溪蟹生殖发育的特殊性相关。