4种鲤科鱼类精子特性及不同pH对其活力的影响

王 雨，杨 建，耿龙武，张宇婷，姜海峰，徐 伟

(1.上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306；2.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨 150070；3.上海海洋大学，农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306)

鱼类的精子活力主要是指精子寿命和精子运动状态等[1]，主要以精子激活比例和精子运动时间等作为主要评价指标[2]，精子活力的大小直接制约着精子的受精能力[3]。研究表明，水体中pH、无机离子、温度、有机溶剂等因素对精子活力影响显著[4]。我国东北地区盐碱水域因其高碱度、高pH值等水质特点[5]，对鱼类的生长、繁殖影响较大，导致品种单一，渔业生产处于较低的水平。因此，开展pH对淡水鱼类精子活力相关研究，对筛选适应不同盐碱水体环境的增养殖鱼类品种具有重要意义。

拟赤梢鱼(Pseudaspiusleptocephalus)、洛氏鱥(PhoxinuslagowskiiDybowskii)、松浦镜鲤(CyprinuscarpioSongpu)和方正鲫(C.auratus)均属于鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)鱼类，其中，洛氏鱥、松浦镜鲤、方正鲫因其环境适应能力强[6-9]，是目前黑龙江水产研究所在盐碱水域示范推广的重点鱼类品种。本研究通过显微观察法，研究了pH对拟赤梢鱼、洛氏鱥、松浦镜鲤和方正鲫精子活力的影响，旨在阐明4种鱼类精子的酸碱耐受性，完善不同pH环境鱼类的繁殖生物学特性，为东北盐碱地区的渔业生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

实验鱼取自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所呼兰试验站，选择成熟度好、健康无伤、体型正常拟赤梢鱼、洛氏鱥、松浦镜鲤和方正鲫各6尾，随机选择3尾鱼精液用于精子活力和精液理化性质检测，4种鱼类样品质量参数见表1。

表1 4种鲤科鱼类样品质量参数

1.2 不同梯度试剂的配制

根据郑学斌等[10]、李常键等[11]对鲤科鱼类精子活力的研究，用0.1 mol/L的盐酸溶液和0.1 mol/L氢氧化钠溶液与去离子水分别配制5种pH为3.0、5.0、7.0、9.0、11.0的梯度溶液。实验所用的氢氧化钠、盐酸均为国产分析纯。

1.3 精液采集

将选取好的雄鱼进行人工药物催产，待效应时间后，用干燥洁净的毛巾擦去鱼体表面及生殖孔附近的水分，轻压鱼腹部使精液流出，滴入2 mL离心管中，4 ℃暂存待测。精液采集过程中掺入尿液、血液和粪便的样本不予使用。

1.4 精液理化特性测定

1.4.1 精液浓度

精液由精子和精浆组成，精子细胞体积占精液总体积的百分比，即精液浓度[12]。计算公式：

精液浓度=(精液总体积-上清液体积)/精液总体积×100%

本实验将采集的精液取1 mL，常温1 000 r/min离心30 min，每种鱼类测定3个样本，并计算其平均值。

1.4.2 精子密度

本实验取采集的精液2 μL，用0.85%的NaCl溶液，将精液稀释1 000倍，用血球计数板在显微镜下计数，计算精子密度，每种鱼类测定3个样本，结果取平均值。

精子密度(个/mL)=(80小格内精子数/80)×400×104×稀释倍数[13]

1.4.3 精浆pH检测

取新鲜采集精液2 mL，用pH仪(Sartorius)测定精液的pH。

1.5 精子活力观察与测定

用解剖针蘸取微量精液于载玻片上，100 μL移液枪吸取不同pH精子激活液滴加3滴至精液，并迅速用枪头将其搅匀，无需加盖盖玻片，同时用秒表计时，于10×10倍光学显微镜(BX1 Olympus microscope)下观察，并记录精子激活率、快速运动时间、运动时间及精子寿命。精子活力观察标准参照苏德学等[14]的等级标准：精子的激活率以激活起始时给定视野内被激活精子数量占全部精子数量的百分数计算；精子快速运动时间(FT)以精子激活开始至70%的精子能看清运动轨迹的时间计算；精子的运动时间(MT)以精子激活开始至90%的精子原地颤动为止的时间计算；精子的寿命(LT)以精子自然激活开始至90%的精子停止运动为止的时间计算。每个pH梯度每种鱼类检测3个样本，取其平均值。

1.6 数据分析

使用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，结果以平均值±标准差(Mean±SD)表示。采用Duncan法进行多重比较以检验其差异显著性(P<0.05)，使用GraphPad Prism 5.0软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 精液基本理化特征

拟赤梢鱼、洛氏鱥、松浦镜鲤、方正鲫新鲜精液的精液浓度和精子密度如表2所示，精液浓度由高到低依次为松浦镜鲤>方正鲫>洛氏鱥>拟赤梢鱼，精子密度由高到低依次为松浦镜鲤>洛氏鱥>方正鲫>拟赤梢鱼；洛氏鱥精浆偏酸性，拟赤梢鱼精浆呈中性，而松浦镜鲤、方正鲫精浆呈弱碱性。

表2 4种鲤科鱼类精液基本理化特征

2.2 pH对精子活力的影响

pH对精子活力的影响如图1所示，4种鲤科鱼类的精子在pH 3.0～11.0范围内，其活力均随着pH的升高而呈现先升高后降低的变化趋势；其中，拟赤梢鱼、洛氏鱥精子的激活率、FT、MT、LT均在pH 7.0时达到最高，精子激活率分别为(93.99±5.77)%和(96.67±2.89)%，FT分别为(35.32±0.81)s和(34.27±0.49)s，MT分别为(52.24±0.99)s和(44.33±0.76)s，LT分别为(71.50±5.50)s和(75.22±3.50)s；松浦镜鲤精子激活率在pH 7.0时最高，为(96.67±2.89)%，其FT、MT和LT在pH为9.0时达到最大值，分别为(46.80±1.82)s、(64.94±4.52)s和(84.03±7.02)s；方正鲫精子活力的4个指标均在pH 9.0时达到最高，分别为(93.33±2.89)%、(35.37±0.31)s、(85.18±2.04)s和(100.74±1.65)s。

图1 不同pH条件下4种鲤科鱼类精子活力变化

3 讨论

3.1 精液的基本生物学特征

精子密度和精液浓度是评价鱼类精子生物学特性的主要指标。一般而言，同种鱼类精子密度越高，精液浓度越大，而不同鱼类之间鱼类的精子密度和精液浓度因种类不同、精子形态、体积或繁殖季节不同而有各异[15]。

研究发现，不同鱼类精子密度差异较大，如鲟科鱼类精子密度相对较低，波斯鲟(Acipenserpersicus)[16]精子平均密度为1.54×109个/mL，中华鲟(A.sinensisGray)[17]精子平均密度为3.26×109个/mL；而鲤科鱼类精子密度则较高，四大家鱼精子平均密度为2.66×1010个/mL[18]。本研究中的4种鲤科鱼类，其精子密度均与四大家鱼的研究结果相近，其数量级均为1010个/mL。

本研究中，4种鲤科鱼类的精子密度和精浆浓度在种间整体表现为精子密度越大，精液浓度越高的趋势，松浦镜鲤精液浓度与精子密度在4种鲤科鱼类中最高，而拟赤梢鱼精液浓度与精子密度则最低。Noveiri等[16]的研究同样表明，精液浓度和精子密度之间存在着显著正相关性，而鲁大椿等[18]对部分淡水鱼类精液生物学研究中亦有相似发现。此外，在本研究中方正鲫、洛氏鱥精液浓度与精子密度大小顺序相反，推测出现这一现象是因为洛氏鱥精子个体较小，导致精子在精浆中的总体积减小。

在本研究中，拟赤梢鱼精浆呈中性，松浦镜鲤、方正鲫精浆呈弱碱性，而洛氏鱥精浆偏酸性，种间差异较大，但大多数鱼类的精浆pH偏碱性[19]，只有少部分鱼类精浆呈弱酸性，如大黄鱼(Pseudosiaenacrocea)[20]精浆pH为6.7～7.2，目前有关鱼类精浆偏酸性的原因尚不清楚，有学者推测这是与环境相适应的结果[21]。

3.2 pH对精子活力的影响

外界pH环境是影响鱼类精子活力的重要因素之一，当精子处于适宜的pH环境条件下才可被有效激活。研究发现，无论是淡水鱼类[22,23]，还是海水鱼类[24,25]，其精子活力在中性或弱碱性的环境下精子激活率最高，且活性最强，而在酸性条件下鱼类精子激活率降低、寿命短。

本研究证明，拟赤梢鱼、洛氏鱥、松浦镜鲤和方正鲫4种鲤科鱼类精子活力在pH 7.0～9.0时效果较好，而在强酸、强碱胁迫下表现差异较大。在pH 3.0(H+浓度为10-3mol/L)强酸性条件下，拟赤梢鱼精子完全失活，洛氏鱥的精子激活率仅为21%，方正鲫和松浦镜鲤精子仅能原地颤动；而在pH 11.0(OH-浓度为10-3mol/L)强碱条件下，拟赤梢鱼部分精子仍具有活力，方正鲫精子激活率仍可达75%，松浦镜鲤、洛氏鱥精子活力虽然受到抑制，但其激活率仍高于45%。对比强酸与强碱性环境对鱼类精子活力的影响发现，强酸条件对精子活力的抑制作用明显高于强碱环境，这一现象，在黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[26]中也得到了证实。根据Morisawa等[27]的假说，这可能是由于胞外H+浓度的增加会破坏精子细胞结构，进而抑制精子活力和降低受精率所致。

综上所述，拟赤梢鱼精子对水体pH的变化环境最为敏感，而松浦镜鲤、洛氏鱥次之，方正鲫精子对pH适应性较强。在开展鱼类人工繁育过程中，为提高其受精率，拟赤梢鱼使用的水源pH应控制在7.0中性相对稳定的环境，而松浦镜鲤、洛氏鱥、方正鲫pH控制在7.0～9.0弱碱性环境即可。