基于灰色关联度的叠鞘石斛叶抗氧化部位的筛选

阮沛桦 邓红 傅咏梅 张蜀 郭彩娥 黄树滨 李志超

摘  要：以不同浓度乙醇对叠鞘石斛[Dendrobium aurantiacum Rchb. f. var. denneanum （Kerr.） Z. H. Tsi. ]叶进行提取，再用不同极性溶剂对抗氧化活性较高的60%乙醇粗提取物进行萃取，分别得到石油醚层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层，采用超高效液相色谱法（ultra performance liquid chromatography，UPLC）和紫外-分光光度法对各部位进行成分分析，以DPPH自由基清除活性为指标，利用灰色关联度进行相关性分析，筛选主要的抗氧化活性部位。其中，总黄酮在正丁醇层最高（24.89%）;多糖在水层最高（0.23%）;各萃取层均有抗氧化活性，DPPH自由基清除能力强弱顺序为水层>正丁醇层>乙酸乙酯层>二氯甲烷层>石油醚层。筛选出正丁醇层、水层为抗氧化主要活性部位，其抗氧化活性是黄酮类、多糖等成分协同作用的结果，为进一步提取抗氧化活性化合物，开发天然抗氧化剂提供一定的指导。

关键词：叠鞘石斛叶;灰色关联度;抗氧化活性部位;黄酮;多糖

中图分类号：S567;R284      文献标识码：A

Abstract： The leaves of Dendrobium aurantiacum Rchb. var. f. denneanum （Kerr.） Z. H. Tsi. were coarse-extracted with different concentrations of ethanol. And then with different polar solvents， the petroleum ether layer， dichloromethane layer， ethyl acetate layer， n-butanol layer and water layer were obtained from 60% ethanol crude extract， whose antioxidant activity was higher. Those layer obtained were assayed with the ultra performance liquid chromatography （UPLC） and UV-spectrophotometric method. With DPPH antioxidant activity as an index， the grey correlation degree correlation analysis was used to screen the main antioxidant activity. The highest amount of flavonoids， 24.89%， was in the n-butyl alcohol layer， and the highest amount of polysaccharide， 0.23%， layer was in the water layer. Each extraction layer had antioxidant activity， and the free radical clearance ability in order from strong to weak was water layer， n-butanol layer， ethyl acetate layer， dichloromethane layer， petroleum ether layer. Besides， the n-butanol layer and water layer were selected as the main antioxidant active parts. And the antioxidant activity was the result of the synergistic action of flavonoids and polysaccharides， which could provide some guidance for further extraction of antioxidant active compounds and development of natural antioxidants.

Keywords： leaves of Dendrobium aurantiacum Rchb. var. f. denneanum （Kerr.） Z. H. Tsi. ; gray relational degree; antioxidant active site; total flavonoids; polysaccharide

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.026

自由基可損害机体组织和细胞，导致慢性毒性和细胞衰亡，过多的自由基也会诱发癌症等各种疾病[1]，因此，抗氧化剂的研究开发尤为重要。其中，植物类天然抗氧化剂因其安全性高、患者依从性高、可长期服用等优点，成为目前研究的热点之一，广泛应用于食品、化妆品、医学等各个领域[2-3]。

叠鞘石斛[Dendrobium aurantiacum Rchb. f. var. denneanum （Kerr.） Z. H. Tsi. ]，喜温暖、潮湿环境，分布于我国云南、广西、四川等地，收载于2010年版《四川省中药材标准》[4]，是兰科植物叠鞘石斛栽培品的新鲜或干燥茎，临床上用于滋阴除热，养胃生津，具有增强机体免疫力、抗肿瘤和抗氧化等功效[5-6]。近年来，随着对石斛研究的深入，发现除多糖外，黄酮类成分也是另一重要活性部位，主要分布于叶子内[7-9]。大量研究表明[10-15]，石斛中黄酮类化合物的抗氧化作用较强，可有效清除自由基，故石斛黄酮的研究开发具有广阔的前景。但目前对叠鞘石斛的抗氧化活性与化学成分的关联研究仍缺乏系统性的研究基础。叠鞘石斛生长环境特殊、生长期长，对其叶子进行开发和利用，有助于资源的整合，缓解资源紧张局面[16]。

本研究对叠鞘石斛叶提取工艺进行筛选，用不同极性的溶剂进行萃取，得到不同部位的提取物，以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率为药效指标，采用灰色关联度法建立UPLC色谱图与抗氧化活性之间的谱效关系，同时探讨总黄酮和多糖成分与不同部位的抗氧化活性关系，筛选出抗氧化活性部位，以期寻找叠鞘石斛叶抗氧化活性的物质基础，为天然抗氧化剂的研究开发提供依据，为资源的有效整合和利用奠定科学的基础。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  材料与试剂  叠鞘石斛叶（采摘日期为2018年11月5日，产地云南）由云南省文山壮族苗族自治州麻栗坡态合堂野生石斛保育有限公司提供，经广东药科大学何伟教授鉴定。取干燥叠鞘石斛叶，粉碎，过三号筛，备用。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），批号C10088334，上海麦克林生化有限公司;D-无水葡萄糖（纯度99.9%），中国食品药品检定研究所;芦丁标准品（纯度97.5%），中国食品药品检定研究院;芹菜素-6，8-二-c-葡萄苷标准品（纯度99.9%）、异夏佛塔苷对照品（纯度98.7%），中山市成诺生物科技有限公司。乙腈、甲醇、四氢呋喃、磷酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.1.2  仪器与设备  ACQUITY型超高效液相色谱（配置PDA检测器），美国Waters公司;BSA224S-CW万分之一电子分析天平，CP225D十万分之一电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司;UV-1800紫外?可见分光光度仪，日本岛津公司;HK3300H超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司;DFT-200粉碎机，温岭市林大机械有限公司。

1.2  方法

1.2.1  粗提取物的制备  准确称取叠鞘石斛叶粉末0.5 g，置100 mL具塞锥形瓶中，加入不同提取溶剂（水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇）50 mL，在超声频率53 kHz、功率350 W条件下超声处理45 min，得到每毫升约含10 mg药材的粗提取物，再用相应的溶剂稀释成系列浓度溶液。

1.2.2  不同部位提取物的制备  准确称取叠鞘石斛叶粉末5 g，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇的50 mL，在超声频率53 kHz、功率350 W条件下超声处理45 min，提取2次，合并滤液，于70 ℃旋蒸浓缩，再依次用等体积石油醚（60～90 ℃）、二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇进行萃取，每次萃取3次，合并同种溶剂的萃取液，浓缩至干，称重，用甲醇复溶并稀释定容至10 mL量瓶中，得到每毫升约含0.5 g药材的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇层提取物;取上述溶液适量，用甲醇稀释成系列浓度溶液。最后水层浓缩至干，称重，用水复溶并稀释定容至10 mL量瓶中，得到约0.5 g/mL药材的水层提取物，再取适量加水稀释成系列浓度溶液。

1.2.3  DPPH自由基清除能力的测定  精密称取DPPH对照品适量，置于容量瓶中，加入无水乙醇配制成浓度为50 μg/mL的DPPH溶液。分别取1.2.1和1.2.2节制备的系列浓度溶液2 mL，加入2 mL DPPH溶液，混合均匀，避光反应30 min，在200～600 nm下扫描DPPH溶液和样品波长，515 nm波长下有最大吸收，故确定在该波长下检测，样品组吸光值为A1;以2 mL相应的溶剂代替样品为空白组，吸光值为A2;以2 mL无水乙醇代替DPPH溶液为对照组，吸光值为A3;用抗坏血酸（Vc）作为阳性对照。计算样品对DPPH自由基的清除率，通过清除率曲线计算出DPPH自由基清除率为50%时的样品溶液浓度（IC50）。

式中：A1为样品组吸光度值;A2为空白组吸光度值;A3为对照组吸光度值。

1.2.4  3种黄酮成分及总黄酮含量测定  选用Acquity UPLC HSS T3 C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）;流动相A为四氢呋喃-乙腈-甲醇（10∶22∶5），流动相B为0.05%磷酸，梯度洗脱（0～9 min，9%→10%A;9～10 min，10%→11%A;10～12 min，11%→11.5%A;12～13 min，11.5%→14.5%A）;13～20 min，14.5%→15%A;20～25 min，15%A;25～60 min，15%→30%A;60～65 min，30%→9%A），流速：0.3 mL/min;檢测波长337 nm;柱温30 ℃;进样体积2 μL。在此色谱条件下，分别取乙醇粗提取物和不同部位提取物，同时测定黄酮成分芹菜素-6，8-二-c-葡萄苷、异夏佛塔苷和芦丁的含量，并将定性为黄酮类化合物的色谱峰的峰面积加和，即为总黄酮峰面积，以芹菜素-6，8-二-c-葡萄苷为对照用外标法计算总黄酮含量。

1.2.5  多糖含量测定  分别取乙醇粗提取物和不同部位提取物，参照《中华人民共和国药典》[17]铁皮石斛中多糖含量的测定方法进行测定。

1.2.6  灰色关联分析  按照汪洋等[18]的报道，将不同部位提取物相应的清除率数据作为参考数列，色谱图中各色谱峰的峰面积作为比较数列进行灰色关联分析。以黄酮含量、多糖含量为评价数列，抗氧化药效为参考数列，计算关联度。

1.3  数据处理

采用Graphpad和SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析，其中IC50采用回归分析得出。

2  结果与分析

以DPPH自由基清除能力、3种黄酮成分及总黄酮的含量、多糖含量为指标成分进行叠鞘石斛叶的抗氧化活性评价。

2.1  粗提取物的抗氧化活性

以粗提取物的DPPH自由基清除能力评价其抗氧化活性，结果见图1和表1。由结果可知，60%乙醇提取物的DPPH自由基清除能力最高，其次为40%乙醇，水和95%乙醇的提取物最低，说明过高或过低的有机相提取不利于抗氧化活性物质的溶出，故以60%乙醇进行粗提取，再筛选不同极性部位。

2.2  不同部位提取物的抗氧化活性

以不同部位提取物的DPPH自由基清除能力評价其抗氧化活性，结果见图2和表2，可见，叠鞘石斛叶的不同极性部位都对DPPH自由基具有一定的清除作用，清除率强弱顺序为正丁醇层>水层>乙酸乙酯层>二氯甲烷层>石油醚层，在较低浓度下，Vc的DPPH自由基清除能力最强;当浓度达到0.125 mg/mL后，正丁醇层和水层与VC的DPPH自由基清除能力相当;在0.0625～ 1.0001 mg/mL浓度范围内，其他提取层的自由基清除能力远低于Vc阳性对照，表明叠鞘石斛叶正丁醇层和水层部位具有较强的体外抗氧化能力。

2.3  提取物的成分分析

粗提取物各指标成分结果见图1和表1，不同部位各指标成分结果见图2和表2，总粗提取物和不同部位提取物UPLC色谱图见图3和图4，各色谱峰面积信息见表3。根据光谱信息可知，除色谱峰1、2、4、12之外，其余26个色谱峰所代表的成分均具有黄酮类的特征光谱，可定性为黄酮类化合物。

课题组在前期研究中鉴别出叠鞘石斛叶含有3种黄酮类成分，分别是芹菜素-6，8-二-c-葡萄苷、异夏佛塔苷和芦丁。在粗提取物中，3种成分含量由高至低顺序为芦丁>芹菜素-6，8-二-c-葡萄苷>异夏佛塔苷;以60%乙醇进行粗提取，芹菜素-6，8-二-c-葡萄苷、异夏佛塔苷、芦丁及总黄酮含量均最高，推测黄酮成分与抗氧化活性具有一定关联性，故后续建立关联度分析，探讨黄酮类化合物的色谱峰面积与抗氧化活性之间的关系。

在不同部位提取物中，芹菜素-6，8-二-c-葡萄苷、异夏佛塔苷、芦丁均集中于正丁醇部位，该部位的总黄酮含量最高，DPPH自由基清除能力最强;其次是乙酸乙酯部位，总黄酮含量较高;在水、二氯甲烷、石油醚部位中总黄酮含量较低。

多糖为水溶性成分，所以水提取物中的多糖含量最高，并随着乙醇浓度的升高，多糖含量降低，80%和95%乙醇的提取物中并未检出多糖。在不同极性部位中，水层的总黄酮含量不高，多糖含量最高，但抗氧化活性水层与正丁醇层相当，考虑到多糖可能对抗氧化活性存在一定的贡献率，故选择多糖作为指标成分进行研究。

2.4  灰色关联度的研究

各色谱峰与抗氧化活性的关联度分析见表4。由表4结果可知，在关联度排名前10的色谱峰中，有9个是黄酮成分，占90%，可见，DPPH自由基清除能力与黄酮成分密切相关。

黄酮类和多糖成分的关联度结果分别为0.7522和0.5385，均高于0.5，其中黄酮类成分关联度更高，可见，抗氧化活性是由多个成分共同作用的结果，而黄酮类成分的抗氧化活性更高。

3  讨论

现代研究发现，体内过多的自由基累积会对机体造成损伤，导致细胞凋亡，开发出安全性高的天然植物抗氧化剂尤为重要。李芳等[15]和唐静月等[19]在研究中发现，铁皮石斛花中的黄酮类成分具有较高的抗氧化活性;高海立等[20]对铁皮石斛茎总黄酮进行纯化并探讨其抗氧化活性;Singh 等[21]证实铁皮石斛茎甲醇提取物的抗氧化活性，并确定黄酮类化合物的抗氧化活性，但均并未知悉黄酮类的组成成分与抗氧化活性之间的关系，也仅仅局限于对粗提物的分析，并未对醇提物的有效部位进行研究分析。目前对石斛品种的研究多集中于铁皮石斛，对石斛的活性物质研究也多局限于茎部位，叠鞘石斛叶抗氧化活性部位还未见报道。陈佳江等[22]对叠鞘石斛不同部位的化学成分进行分析，发现叶化学成分较茎丰富，且叶的药理活性较高，对高血压、高血脂等症状有显著的辅助治疗作用，对叠鞘石斛叶研究意义重大。本文对叠鞘石斛叶展开研究分析，不仅探讨其不同极性部位与抗氧化活性，还进一步分析抗氧化活性与黄酮类成分的关联度，为下一步提取抗氧化的活性部位，开发天然植物抗氧化剂奠定基础，有利于植物资源的合理分配利用。

本研究选用环保、价廉、适合工业化大规模生产的乙醇作为提取溶剂，以不同浓度乙醇和水进行提取考察，发现60%乙醇总黄酮提取率最高，且抗氧化活性最好，因此，选用60%乙醇制备粗提物;再以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇，依次按溶剂极性从弱到强进行萃取，将叠鞘石斛叶的不同极性成分富集在不同提取层中，能更好地比较、分析不同极性部位的成分和抗氧化能力。通过对叠鞘石斛叶不同极性部位提取层的分析发现，叠鞘石斛叶抗氧化活性有效成分大部分溶于极性较高的部位，而在石油醚、二氯甲烷等极性较低的部位溶解度较低，故提取过程中可用低极性溶剂洗涤，用高极性溶剂提取、分离，以达到富集效果。

采用灰色关联度分析，以关联度作为评价指标，确定各色谱峰对抗氧化活性的贡献大小，在关联度排名前10的色谱峰中，18号峰鉴别为芦丁，对抗氧化活性的贡献较大，其他峰仍有待进一步鉴别;经二极管阵列检测器对全部色谱峰的光谱扫描分析（220～380 nm），石斛中的黄酮成分主要是以芹菜素为苷元的多种黄酮碳苷类，最大吸收波长相近，推测这些黄酮碳苷类化合物是石斛叶子发挥抗氧化活性的物质基础;关联度大的色谱峰的指认和归属也可以从黄酮碳苷类化合物方面考虑。

谱效关系的研究有多种数据处理方法，现采取灰色关联度分析法，反映色谱峰与抗氧化活性的相关性，除此之外，还分析了黄酮类、多糖等大类成分的关联度大小，充分说明了叠鞘石斛叶抗氧化活性并非由单一具体成分起效，而是多个成分共同作用的结果。

基于灰色关联度筛选叠鞘石斛叶抗氧化活性部位，结果证明其抗氧化活性成分黄酮类、多糖等主要集中在正丁醇、水等高极性提取层，表明叠鞘石斛叶可作为食品和治疗中的新型植物抗氧化剂，从中筛选抗氧化活性强的萃取层，进一步提取抗氧化活性强的化合物，为叠鞘石斛叶的综合开发利用奠定坚实的基础。

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