巴西橡胶树小孢子单细胞显微分离研究

杨星星 王英 庄南生 高和琼 王宇翔

摘  要：巴西橡胶树是一种重要的热带作物。以巴西橡胶树‘热研7-33-97处于减数分裂四分体时期的幼嫩雄花为试验材料来获取单细胞，利用5%纤维素酶、5%果胶酶、5% β-葡聚糖酶、5%纤维素酶与4%果胶酶混合酶4种酶液，探索酶解四分体胼胝质的最佳方案。结果表明：在37 ℃条件下酶解1 h，5%纤维素酶与4%果胶酶混合酶的酶解效果最佳，可得到品质良好的小孢子单细胞。通过对拉制针尖细长度、磨针斜口直径以及显微操作分离体系的不断探索与试验，成功建立一套适合巴西橡胶树‘热研7-33-97小孢子单细胞的显微分离技术体系。小孢子单细胞是减数分裂的直接产物，对小孢子单细胞进行分离并分析可精确解析橡胶树减数分裂过程中基因的重组与交换，确定橡胶树基因组的变异情况。该研究结果将为橡胶树单细胞全基因组测序提供理论与技术支持。

关键词：巴西橡胶树;显微分离;单细胞;四分体

中图分类号：Q943      文献标识码：A

Abstract： Hevea brasiliensis is an important tropical crop. In this study， the young male flowers of ‘Reyan 7-33-97 in the meiotic tetrad period were used as the experimental materials to obtain single cells. Four enzymatic solutions， 5% cellulose， 5% pectinase， 5% β-glucanase， 5% cellulase and 4% pectinase mixed enzyme solution， were used in the experiment to explore the best scheme for the degradation of tetrad callose. As a result， under the condition of 1 h and 37 ℃， 5% cellulase and 4% pectinase mixed enzyme solution had the best enzymatic hydrolysis effect， and the single microspore with good quality could be obtained. Through the continuous exploration and experiment on the fine length of the needle tip， the diameter of the sharpening of the needle and the micro-operation separation system， a set of microdissection technology system suitable for the single microspore of ‘Reyan 7-33-97 was successfully established. Single-microspores were the direct products of meiosis. The separation and analysis of single cells could accurately resolve gene recombination and exchange during the meiosis of rubber trees， and determine the genomic variation. The study would provide theoretical and technical support for single-cell whole genome sequencing of H. brasiliensis.

Keywords： Hevea brasiliensis; microdissection; single cell; tetrad

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.003

顯微操作分离技术是利用倒置显微镜、显微操作器，结合电动机械控制的毛细玻璃针进行分离单个细胞或者单染色体的技术[1-2]，操作具有灵活取样、目标明确、操作简单、成本低等优点，是一种较常用的分离技术。据统计，自显微分离技术建立以来，就因其优势在动物遗传学[3-5]、医学[6-7]、微生物学[8-10]等诸多领域得到广泛应用。然而，由于植物细胞的特异性，这项技术在植物中的应用受到限制，技术进展缓慢。随着植物细胞遗传学的发展及研究者在技术上的不断追求与创新，植物显微操作分离技术被日益完善，也相继实现了植物染色体[10-11]、体细胞[12-13]等的分离。在植物中的单细胞分离技术是实现植物单细胞水平研究的基础[14]，可为构建SNP细胞遗传图谱、植物分子育种等研究提供技术基础。近年来，在测序时，研究者采用的样品多是细胞群体或是大量细胞的混合DNA，这样获得的全基因组序列信息，仅是多数占优势的细胞所表达的某些明显的序列信息，而忽视了少数细胞表达的差异性[15-18]。世界上不可能存在2个完全相同的细胞，单个细胞间的表达调控同样存在差异[19]，为了获得细胞异质性表达的微量序列信息，单细胞全基因组测序应运而生。目前，关于植物单细胞的分离研究已有少量报道，如2015年李响[20]利用显微分离技术成功分离出玉米小孢子单细胞，解析了玉米减数分裂重组机制，构建了玉米SNP图谱;Kubo等[21]利用显微分离技术成功分离出小立碗藓叶片的单细胞，建立了单细胞数字基因表达，完成单细胞测序。

2.3  4种酶液对巴西橡胶树雄花四分体胼胝质的酶解效果

小孢子母细胞发育到减数分裂后期，胼胝质包裹着四分体。试验发现若要得到小孢子单细胞，通过物理手段难以实现。本研究对4种酶液在不同温度及时间条件下的巴西橡胶树雄花四分体胼胝质的酶解效果进行探索，结果见表3和图3。从表3可见，同种酶液在相同的酶解时间内，温度对四分体胼胝质的酶解情况影响不大。图3展示的是37 ℃条件下4种酶液在不同时间内对四分体胼胝质的酶解情况。综合分析表3和图3可知，（1）酶解1 h时，5%纤维素酶与4%果胶酶混合酶完全酶解四分体胼胝质，释放出小孢子单细胞，酶解率为100%（图3A），其余3种酶液均未释放出小孢子单细胞;其中，5%纤维素酶开始酶解四分体外围胼胝质，酶解率约为65%～75%（图3B），而5%果胶酶、5%β-葡聚糖酶均未酶解胼胝质，酶解率为0（图3C、D）。（2）酶解3 h时，5%纤维素酶基本酶解四分体外围胼胝质，酶解率约为88%～90%;5%果胶酶开始起作用，出现释放小孢子单细胞现象，酶解率约为25%～ 32%;5% β-葡聚糖酶未酶解胼胝质，酶解率为0（图3E～G）。（3）酶解6 h时，5%纤维素酶完全酶解掉外围胼胝质，酶解率达到95%～98%，但四分体的4个小孢子单细胞仍然相连;5%果胶酶酶解释放出多个小孢子单细胞，但仍有胼胝质残留，酶解率约80%～85%;5% β-葡聚糖酶的酶解率仅有20%～25%，可使胼胝质层变薄，但不能释放出小孢子单细胞（图3H～J）。研究结果表明：在37 ℃条件下，采用5%纤维素酶与4%果胶酶混合酶，酶解时间为1 h时是酶解巴西橡胶树雄花四分体胼胝质的最佳方案。在适宜温度内，橡胶树四分体胼胝质的酶解效果与酶液种类与酶解时间有关，其酶解效率见表3。

2.4  巴西橡胶树小孢子单细胞的显微分离技术体系

借助已建立的巴西橡胶树‘热研7-33-97单个四分体的显微分离技术体系，分离出单个四分体，利用酶解四分体释放出的4个小孢子单细胞，建立适合于分离巴西橡胶树‘热研7-33-97小孢子单细胞的显微分离技术体系。具体体系如下：（1）37 ℃条件下，采用5%纤维素酶与4%果胶酶混合酶酶解1 h，释放出4个小孢子单细胞;步骤（2）～（8）参照已建立的巴西橡胶树‘热研7-33-97单个四分体的显微分离技术体系（1）～（7），其中步骤（3）因为分离材料的不同，略有改动，磨出的斜口直径调整为30～40 μm;（9）重复步骤（6）～（8），直至将4个小孢子单细胞全部转移于含有10 μL 27%山梨醇缓冲液的PCR管内，4 ℃冰箱中保存。利用该技术体系，先后成功分离出582个小孢子单细胞，成功率约为90%，其中完整的来自同一个四分体的4个单细胞的成功率为70%～80%。巴西橡胶树‘热研7-33-97小孢子单细胞的显微分离过程如图4所示。

3  讨论

本研究发现在制备巴西橡胶树雄花的四分体标本时，未经染色的巴西橡胶树雄花在相差显微镜下无法观察到四分体细胞，所以需要在制备四分体悬液前对雄花进行染色。改卡宝品红主要应用于减数分裂、染色体染色，具有染色效果好、时间短、染色稳定等优点，是很好的细胞染色剂[30]，故采用改卡宝品红染色液对橡胶树雄花进行染色处理。在制备标本过程中，为了尽量避免外源污染，对试验中所用试剂、载玻片、镊子等试验器具进行严格的灭菌处理，整个制备过程在超净工作台中进行。在标本制备中，笔者发现初制备的细胞悬液在一定程度上含有花药壁等杂质，因此我们利用移液器对其进行简单的细胞稀释与挑选，有利于后期利用显微分离获得干净、无杂质的橡胶树单个四分体。

胼胝质是一种以β-1，3键结合形成的线性葡聚糖[31-32]，广泛存在于高等植物的细胞壁中[33]，在植物的筛管代谢、配子体发育等生命活动中具有重要的调节作用，其合成与分解可直接影响植物正常的生长代谢过程。四分体是花粉母细胞经减数分裂后形成的产物，花粉母细胞减数分裂前期开始形成胼胝质，在早四分体时期达到最厚，形成雄配子体前胼胝质未解体[34]。本研究为了得到来源于同一四分体的4个小孢子单细胞，笔者利用显微分离得到的单个四分体，对其进行酶解因素的探索，结果发现在37 ℃条件下酶解1 h，利用5%纤维素酶与4%果胶酶混合酶降解四分体胼胝质的效果最佳，这与高和琼等[27]在制备橡胶树染色体标本时所达到的试验结果类似。同时，本研究还发现5%纤维素酶和5%果胶酶也具备酶解胼胝质作用，但2种酶液的酶解方式有所不同，纤维素酶从四分体外部逐渐溶解胼胝质，但不具备释放4个单细胞的作用，5%果胶酶则直接作用于小孢子单细胞所在部位的胼胝质，逐一释放小孢子单细胞，虽可达到试验目的，但所需时间过长，建议不采用，纤维素酶与果胶酶酶解四分体胼胝质的方式与邓秀新等[35]报道的酶解柑桔四分体原生质体的方式相同。

本研究利用显微操作技术分离单个四分体和小孢子单细胞。在操作前使用乙醇脱脂棉对拉针仪、磨针仪以及倒置显微镜等仪器设备进行酒精消毒，试验所用试剂、工具等进行严格灭菌处理，尽量减少在试验过程中可能产生的外源污染，这与王发明等[36]、殷卉等[37]在显微分离植物单染色体试验中减少污染的方法相同。为了建立一套适合分离橡胶树单个四分体和小孢子单细胞的显微分离技术体系，笔者对试验体系进行了严格的分析与摸索。笔者发现，拉针时，拉针仪的热值越高，针尖越长，口径越细，为保证针尖部位的细长，设置80 ℃高溫，以避免毛细玻璃针在磨取针尖部位后，管壁口径太大，影响视野;分离单个四分体时，因四分体直径大小约60 μm，毛细玻璃针磨取的斜口直径需>60 μm，分离小孢子单细胞时，考虑到小孢子单细胞直径大小过小约30 μm，因此在磨制玻璃针时，调整斜口直径为30～40 μm;利用5%纤维素酶与4%果胶酶混合酶获得的小孢子单细胞，为避免有酶液残留，在分离过程中需要多次更换27%山梨醇缓冲液的液体环境，反复进行吸取与吹打，保证最终分离保存的小孢子单细胞无酶液残留。通过总结显微分离经验，笔者发现分离单个四分体的成功率可达100%，但分离小孢子单细胞的成功率约为90%，其中来自同一个四分体的4个单细胞的成功率仅为70%～80%。分析出现这种情况的原因：一方面是小孢子单细胞过小，在分离过程中会丢失;另一方面是操作者的分离技术。因此，操作者应熟练掌握分离技术，提高操作水平，是保证试验成功的基础。

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