RXRA在头颈部恶性肿瘤组织中的表达情况及其临床意义*

肖红梅, 陈荣, 姜应梅

遵义医学院附属医院 1肿瘤科， 2预防保健科(贵州遵义 563000)

头颈部恶性肿瘤是指发生在口腔、咽、喉和甲状腺等部位的恶性肿瘤，具有较强的肿瘤浸润和转移能力，其恶性程度较高[1-2]。目前关于头颈部恶性肿瘤的治疗，临床上主要采用手术为主的治疗方式，辅以放疗、化疗等治疗手段[3-4]。视黄酸X受体α(RXRA)属于非类固醇受体家族，在细胞增殖、分化、代谢、炎症等生理功能方面发挥广泛的调控作用[5-8]。在多种肿瘤细胞中，RXRA以N端切割形式tRXRA发挥促癌作用，主要的机制包括激活磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B (PI3K/AKT)、核转录因子-κB (NF-κB)等信号通路[9-10]。最新的研究还发现RXRA能够与promyelocytic leukemia/retinoic acid receptor alpha (PML/RARA)相互作用形成复合物，促进急性早幼粒细胞白血病的发展[11-14]。这些证据都说明RXRA的异常表达在癌症的发生、发展过程中可能发挥促进作用。而关于RXRA在头颈部恶性肿瘤中研究还未见相关的报道，2017年10月至2019年3月，本研究探索RXRA在头颈部恶性肿瘤中的表达水平，并分析其与肿瘤大小、组织分化程度等临床病理特征之间的关系，并分析其在头颈部恶性肿瘤中与DNA甲基化转移酶之间的调控关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 70例头颈部恶性肿瘤病例收集于遵义医学院附属医院，患者在术前均未进行过化疗、放疗及其他治疗。其中男38例，女32例，≥60周岁15例，<60周岁55例。其中淋巴结转移患者19例。组织标本取材于手术中，储存于超低温冰箱中保存。本研究获得我院伦理委员会批准。70例头颈部恶性肿瘤组织根据RT-qPCR分析RXRA的mRNA表达水平，根据中位数法，将70例头颈部恶性肿瘤患者分为RXRA高表达组和RXRA低表达组，其中高表达组35例，低表达组35例。

1.2 主要试剂 总RNA提取试剂盒，反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒均采购于TaKaRa宝日医生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 总RNA提取 临床组织标本从超低温冰箱中取出置于冰上解冻，加入总RNA提取试剂，组织匀浆机匀浆后，置于冰上20 min，充分裂解细胞。在4℃下12 000g/min离心15 min，取上清到新的离心管中，加入预冷的异丙醇，充分混匀，静置10 min后，12 000g/min离心15 min，弃去上清液，白色沉淀即为提取的总RNA。加入1 mL的75%乙醇洗涤2次去除溶剂污染，4℃下7 500g/min离心5 min，弃去上清液，室温干燥5 min，加入DEPC水溶解总RNA。

1.3.2 荧光定量PCR(RT-qPCR) 将提取的总RNA 按照反转录试剂盒的说明书进行反转录，获得第1条链的cDNA，以此为模板DNA进行荧光定量PCR。荧光定量采用SYBR Green染料，分析方法采用2-ΔCT。

1.3.3 TCGA数据库分析 从TCGA数据库中提取头颈部恶性肿瘤的RXRA基因表达矩阵，采用Transcript Per Million (TPM)的方法进行基因表达水平的分析，数据采用log2的方式进行展示。RXRA启动子甲基化水平的分析是基于TCGA头颈部恶性肿瘤数据库，利用450k Methylation Array进行分析头颈部恶性肿瘤组织和癌旁组织的RXRA启动子甲基化水平变化。利用cBioPortal for Cancer Genomics数据库分析TCGA头颈部恶性肿瘤数据库中RXRA共表达基因，分析RXRA与DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达相关性，相关性采用Spearman进行分析。DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B在头颈部恶性肿瘤组织中的表达利用GEPIA在线工具，分析其在头颈部恶性肿瘤及癌旁组织中的表达差异。

2 结果

2.1 RXRA在头颈部恶性肿瘤组织和癌旁组织中的表达 对519例头颈部恶性肿瘤组织和44例癌旁组织中RXRA的基因表达水平，RXRA在头颈部恶性肿瘤组织中的表达中位数为5.61，而癌旁组织中RXRA的表达中位数为5.13，RXRA在头颈部肿瘤组织中呈高表达(P<0.001)，见图1。进一步分析RXRA在不同肿瘤分型头颈部恶性肿瘤组织中的表达，发现在非规则型、基底型和经典型头颈部恶性肿瘤标本，RXRA的表达无显著变化。而在间充质头颈部恶性肿瘤组织中RXRA的表达有所降低，但与其他肿瘤分型的头颈部恶性肿瘤相比，无显著的变化。

注：*P<0.001图1 RXRA在头颈部恶性肿瘤组织中的表达

2.2 头颈部恶性肿瘤组织中RXRA的表达与临床病理特征之间的关系 本研究还进一步在收集的临床标本中进行验证，发现RXRA在癌旁组织中的表达中位数为2.32，而肿瘤组织中的表达中位数高达4.58，因此相对于癌旁组织，头颈部恶性肿瘤组织中RXRA的表达显著上调(P<0.001)，见图2-A。根据肿瘤最大径是否>3 cm，将70例头颈部恶性肿瘤组织分为两组，发现在肿瘤最大径>3 cm的组织中其RXRA的表达中位为5.3，而肿瘤最大径<3 cm的肿瘤组织中RXRA的表达中位数3.79，RXRA在肿瘤最大径≥3 cm的肿瘤组织中表达显著高于肿瘤最大径<3 cm的组织，见图2-B。根据患者是否存在肿瘤淋巴结转移分析发现，在淋巴结转移的头颈部恶性肿瘤组织中RXRA的表达中位数为6.7，也显著高于未转移肿瘤组织中的3.8(P<0.001)，见图2-C。根据RXRA表达中位数法将70例头颈部恶性肿瘤组织分为RXRA高表达组和RXRA低表达组，分析发现RXRA表达与患者的性别(2=0.32,P=0.572)和年龄(2=0.561,P=0.453)均无显著联系。而RXRA表达水平与肿瘤大小(2=6.341,P=0.012)、淋巴结转移(2=24.5,P=0.000)以及组织分化程度(2=8.138,P=0.004)均存在显著的相关性，见表1。

注：A：分析70例头颈部恶性肿瘤组织和癌旁组织；B：按照肿瘤最大径进行分组分析基因表达水平；C：按照患者是否发生淋巴结转移分组，分析基因的表达水平。*P<0.001图2 RXRA与头颈部恶性肿瘤进展的关系

表1 HNSC中RXRA表达高低与临床病理特征的关系 例

2.3 RXRA启动子甲基化水平分析 分析头颈部恶性肿瘤组织中RXRA启动子的甲基化水平，发现528例头颈部恶性肿瘤组织中RXRA的启动子甲基化水平的中位数为0.068(0.060,0.077)，而癌旁组织中RXRA启动子的甲基化水平中位数为0.072(0.067,0.087)，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。

注：*P<0.001图3 头颈部恶性肿瘤组织中RXRA的启动子甲基化水平

2.4 RXRA与DNA甲基转移酶相关基因的表达相关性 分析TCGA头颈部恶性肿瘤数据库中，RXRA与DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达相关性，发现RXRA与DNMT1基因的共表达相关系数为0.13(P<0.01)，而RXRA与DNMT3A基因的共表达相关系数为0.29(P<0.01)，RXRA与DNMT3B基因的共表达相关系数为0.37(P<0.01)，见图4。

注：A：RXRA与DNMT1相关性；B：RXRA与DNMT3A相关性；C：RXRA与DNMT3B相关性图4 头颈部恶性肿瘤组织中RXRA与DNA甲基转移酶的相关性

2.5 DNA甲基转移酶相关基因在头颈部恶性肿瘤中的表达水平 基于TCGA头颈部恶性肿瘤数据，采用GEPIA工具分析DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达水平。发现在DNMT1在头颈部恶性肿瘤中的表达中位数为5.2，而癌旁中DNMT1的表达中位数为3.9，癌旁中DNMT1的表达显著低于肿瘤组织(P<0.05)，DNMT3A在头颈部恶性肿瘤中表达中位数为3.0，而在癌旁中表达中位数为2.4，DNMT3A在头颈部肿瘤组织中呈高表达(P<0.05)，而DNMT3B在头颈部恶性肿瘤中表达中位数为1.9，癌旁中DNMT3B表达中位数为0.4，DNMT3B在头颈部肿瘤组织中的表达也显著高于癌旁组织(P<0.05)。见图5。

注：A：DNMT1基因在头颈部恶性肿瘤及癌旁组织的mRNA表达水平；B：DNMT3A基因在头颈部恶性肿瘤及癌旁组织的mRNA表达水平；C：DNMT3B基因在头颈部恶性肿瘤及癌旁组织的mRNA表达水平,*P<0.05图5 DNA甲基转移酶相关基因在头颈部恶性肿瘤组织中的表达水平

3 讨论

头颈部恶性肿瘤的治疗方式主要依靠手术，辅以化疗和放疗。而头颈部恶性肿瘤因其发病部位隐蔽性强，往往确诊时已经进入进展期，因此手术治疗效果不尽如意[15-16]。而放疗的高辐射毒性以及化疗的耐药性也同样制约着头颈部恶性肿瘤的治疗[17-19]。因此深入研究头颈部恶性肿瘤的发病机制，对于研发抗头颈部恶性肿瘤药物具有非常大的实际意义。

先前的研究表明RXRA在多种肿瘤中呈异常表达，而在头颈部恶性肿瘤中未见相关的报道。而本研究发现RXRA在头颈部恶性肿瘤组织中高表达，并且其表达与头颈部恶性肿瘤的肿瘤分型无显著的相关性，而RXRA的表达水平与肿瘤的大小、肿瘤组织的分化程度以及是否发生淋巴结转移存在显著的正相关的关系，这些结果表明RXRA在头颈部恶性肿瘤中的高表达可能扮演着促癌因子的角色，深入研究RXRA在头颈部恶性肿瘤中的表达具有非常大的临床意义，其有可能成为头颈部恶性肿瘤的潜在治疗靶点。RXRA在头颈部恶性肿瘤中高表达，那么其异常表达的调节机制是什么呢？最近的研究发现，DNA的甲基化修饰是基因表达调控失调的重要原因[20]，那么RXRA在头颈部恶性肿瘤中的甲基化水平是怎样的呢？分析发现对于癌旁组织，在头颈部恶性肿瘤的肿瘤组织中RXRA的启动子甲基化水平显著下调，而DNA的甲基化作为一种重要的表观遗传学调控方式，在基因的转录表达方面发挥重要的作用[21-22]，这说明RXRA在头颈部恶性肿瘤中过表达与其甲基化修饰调控存在密切的联系。

为了进一步分析RXRA在头颈部恶性肿瘤组织中高表达与其启动子甲基化潜在的调控机制，我们分析发现在头颈部恶性肿瘤组织中RXRA与DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B存在正相关的关系，表明RXRA与DNA甲基转移酶存在紧密的调控机制，DNMT1、DNMT3A和DNMT3B在肿瘤组织中RXRA的低启动子甲基化水平过程发挥着潜在的功能。

最新的研究发现DNA甲基化等表观遗传学修饰在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用。有研究发现，特定基因的启动子区域甲基化水平可以作为肿瘤诊断的辅助手段用于肿瘤的诊断和治疗的预后评价[23-25]。而本研究中发现RXRA在头颈部恶性肿瘤中异常表达与其启动子区域的甲基化修饰存在密切的联系，因此在后续的研究中值得进一步深入的探讨。

综上所述，本研究发现RXRA在头颈部恶性肿瘤中高表达，并且其异常表达与肿瘤大小、淋巴结转移、肿瘤组织恶性程度存在紧密的联系，并且RXRA的异常表达于其甲基化修饰存在潜在的调控关系，其有可能是头颈部恶性肿瘤治疗的潜在靶点。