miR-665在宫腔粘连及宫颈癌患者中的表达及意义

祝晓玲, 刘淑梅, 杨爱华, 陶安福

1天津医科大学中新生态城医院妇产科(天津 300467)； 2天津海滨人民医院妇产科(天津 300450)； 3国家肿瘤临床医学研究中心、天津医科大学肿瘤医院检验科(天津 300060)

宫腔粘连(IUAs)，也称为Asherman综合征，其特征在于子宫或子宫颈内的瘢痕组织的发展，并导致子宫内膜表面部分或完全发生黏附[1]。宫腔粘连最常见的原因是子宫手术，其主要临床表现为月经过少、闭经、周期性腹痛、异常妊娠或继发性不孕等[2-3]。宫腔粘连一旦出现并发展起来，其对各种疗法都产生或多或少的抵抗力，并且许多患者的预后很差。患有宫腔粘连的育龄妇女即使经过长期治疗，仍可能会出现不孕或反复流产的情况，而且很大部分的宫腔粘连患者在后期极易发展成为宫颈癌，严重影响女性的生理健康[4]。虽然人们普遍认为这种疾病是由子宫内膜基底层引起的损伤造成的，但是，目前还是有许多关于宫腔粘连发病机制的假设，包括纤维细胞增生，细胞外基质过度沉积和纤维结缔组织增生，纤维化等[5]。宫腔粘连发生、发展的分子机制还不太明确。最近，许多miRNA已确定在多种类型的细胞中对纤维化的发生、发展起到重要作用，包括肝、肾、心脏、宫腔和口腔黏液组织等[6-8]。最近的研究报道miR-29b通过TGF-β1/ Smad上皮间质转化途径在子宫内膜粘连中起到重要的调节功能[9]。miR-1291作用于ArhGAP29的上游并负性调节RhoA/ROCK1通路来促进上皮-间质转化进程，最终导致子宫内膜粘连的发生[10]。miR-326通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路抑制子宫内膜纤维化，提示miR-326可能是宫腔粘连的预后生物标志物和治疗靶点[11]。但是，国内外目前还没有关于miR-665在宫腔粘连中作用机制的报道。本研究旨在探讨miR-665在宫腔粘连及宫颈癌患者中表达水平及作用机制，以期为宫腔粘连及宫颈癌患者的早期预防、精准诊疗提供有价值的分子生物学标志物。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究中的宫腔粘连组织和其对照正常组织均取自天津医科大学中新生态城医院和天津海滨人民医院，取材时间段为2016年1月至2019年3月。所有标本的获取都经过患者的知情同意，并且得到伦理道德委员会的批准。手术后立即将标本置于液氮罐内，置于-80℃冰箱，备用。人子宫内膜上皮细胞(hESC)购自北京中原生物科技有限公司。胰酶购于美国Sigma公司；转染试剂Lipofectamine 2000、Trizol试剂和逆转录试剂盒均购于美国Invitrogen 公司；DMEM/F12培养基和胎牛血清均购于美国Gibco公司；CCK8购于上海碧云天生物有限公司；Transwell小室购自天津莱博公司；实时荧光定量 PCR试剂盒购于南京诺唯赞公司；蛋白裂解液RIPA购于沈阳万类生物科技有限公司；E-cadherin、ICAM1、Vimentin、α-SMA、COL1A1、DNA损伤调节自噬调节因子1(DRAM1)和GAPDH抗体购于Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和转染 hESC细胞在含有10%胎牛血清、0.2% collagenase I、100 U/mL青/链霉素的DMEM/F12培养基中，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。取对数生长期的细胞，分别按照12孔板或者96孔板各5×104/孔、5×103孔的量铺板，18 h后按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书转染，分为miR-NC和miR-665 mimics组，按既定的时间做相关的实验。

1.2.2 CCK8 检测细胞增殖 细胞转染0、24、48 h后每孔加入10 μL CCK8试剂，避光培养4 h后测定OD450值，细胞活性按照CCK8试剂盒说明书计算并作图。

1.2.3 集落形成实验 hESC细胞转染24 h后收集并计数，按照500个/孔的数量接种在12孔板内，每3 d更换培养基，大约2周后处理细胞。先用1×PBS清洗一遍，再用结晶紫染料染色并计数。

1.2.4 细胞迁移实验 hESC细胞转染24 h后，将miR-NC和miR-665 mimics组细胞用无血清的DMEM/F12重悬，各取200 μL加到Transwell小室中，每孔加5×104个hESC细胞，下室加600 μL含有20% FBS的DMEM/F12培养基，每组3个复孔，48 h后用4%的多聚甲醛室温固定并用0.1% 结晶紫染色，各15 min，拭去未迁移的细胞后拍照并计数，作图。

1.2.5 实时荧光定量 PCR检测miR-665和DRAM1的表达水平，临床组织标本加液氮研磨后用Trizol法提取总RNAs。转染后的细胞经过48 h后用Trizol法提取总的RNA。用分光光度计检测RNA的纯度。反转录成cDNA后，以U6为内参进行荧光定量PCR分析，实验步骤按照试剂盒说明书进行。实验中所需的引物序列如下：

miR-665-qPCR-For：5′-TGCGGACCAGGAGGCTGAG-3′; miR-665 Rev:5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′; U6-For：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′；DRAM1-qPCR-For：5′-CAGAGGACAGACAGGGTT-3′；DRAM1-qPCR-Rev：5′-AACCAAGGTCTTCCGTAT-3′; β-actin-qPCR-For: 5′-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3′; β-actin-qPCR-Rev: 5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3′。

1.2.6 Western blot 检测蛋白的表达量 细胞收集后用1×PBS洗一遍，加入RIPA裂解液重悬后冰上裂解30 min，中间再混匀一次，4℃、 12 000 r/min的条件离心10 min，收集上清液，用BCA蛋白浓度定量试剂盒完成浓度检测。变性后的蛋白用10%的SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜，5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，4℃敷过夜，1×TBST洗3遍，每遍10 min；室温敷二抗1 h，1×TBST洗3遍，每遍10 min，一、二抗均按1∶1 000稀释。最后滴加发光液并在暗室曝光。

2 结果

2.1 miR-665在宫腔粘连患者组织中的表达 miR-665在50例宫腔粘连患者组织中低表达，其表达水平与宫腔粘连的恶性程度呈负相关(图1-A、1-B)。另外，我们化学合成了miR-665模拟物，并在hESC细胞中验证miR-665模拟物显著上调miR-665的表达水平(图1-C)。

注:A: RT-qPCR检测宫腔正常组织及粘连组织中miR-665的表达水平；B: RT-qPCR检测正常组织及不同严重程度的粘连组织中miR-665的表达水平；C: RT-qPCR检测miR-665模拟物在hESC细胞中的有效性；miR-665 mimics: miR-665模拟物;*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001图1 miR-665在宫腔粘连患者中的表达水平

2.2 miR-665抑制hESC细胞的增殖能力和上皮-间质转化进程 CCK8实验表明miR-665模拟物能够显著抑制hESC的细胞活性(图2-A)。集落形成实验表明miR-665模拟物能够显著抑制hESC的细胞增殖能力(图2-B)。Transwell迁移实验表明miR-665模拟物能够显著抑制hESC的细胞迁移能力(图3)。Western blot实验表明miR-665模拟物能够显著促进hESC细胞中E-cadherin的表达并抑制ICAM1、Vimentin、α-SMA、COL1A1的表达 (图4)。

注：A：CCK8检测miR-665模拟物对hESC细胞活性的影响；B：集落形成实验检测miR-665模拟物对hESC细胞增殖能力的影响图2 miR-665模拟物抑制细胞增殖

图3 Transwell实验检测miR-665模拟物对hESC细胞迁移能力的影响

注：A：Western blot检测miR-665模拟物对上皮间质化的相关蛋白表达的影响；B：Western blot检测miR-665模拟物对纤维化的相关蛋白表达的影响；*P<0.05，**P<0.01图4 Western blot检测miR-665模拟物对相关蛋白表达的影响

2.3 miR-665能够直接靶定DRAM1 Targetscan及StarBase数据库预测，miR-665能够直接靶定DRAM1(图5-A)。我们构建了DRAM1的EGFP荧光报告载体，结果证明miR-665模拟物转染hESC细胞后能够降低荧光的强度(图5-B)。RT-qPCR实验显示miR-665模拟物转染hESC细胞后能够降低DRAM1的 mRNA水平(图5-C)。Western blot实验分析miR-665模拟物转染hESC细胞后能够降低DRAM1的蛋白水平(图5-D)。

注：A: Targetscan及StarBase生物信息学预测miR-665的靶定位点;B: EGFP报告载体实验验证miR-665与DRAM1的靶定关系;C: RT-qPCR检测miR-665模拟物对DRAM1 mRNA水平的影响;D: RT-qPCR检测miR-665模拟物对DRAM1 蛋白水平的影响;*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001图5 miR-665直接靶定DRAM1

2.4 miR-665通过调控DRAM1缓解体内宫腔粘连的进程 体内实验证明，HE染色显示miR-665模拟物能够显著缓解人工诱导大鼠的宫腔粘连；免疫组化实验结果显示miR-665模拟物能够降低DRAM1的表达水平(图6-A)。RT-qPCR和Western blot实验证明miR-665组能够降低组织中DRAM1的mRNA水平和蛋白水平(图6-B、6-C)。

注：A: 免疫组化染色检测DRAM1在大鼠宫腔组织的表达分布;B: RT-qPCR检测大鼠宫腔组织中DRAM1 mRNA的水平变化;C: Western blot检测大鼠宫腔组织中DRAM1蛋白的水平变化;D: Western blot检测转染后hESC细胞中上皮间质化的相关蛋白的表达水平;E: Western blot检测转染后hESC细胞中纤维化相关蛋白的表达水平;*P<0.05, **P<0.01图6 miR-665通过DRAM1发挥作用

2.5 miR-665通过调控DRAM1发挥其抑制性作用 Western blot实验证明DRAM1能够抑制hESC细胞E-cadhernin的表达，促进hESC细胞ICAM1、Vimentin、α-SMA、COL1A1的表达(图6-D、6-E)。

2.6 miR-665和DRAM1在宫颈癌患者中的表达水平 TCGA和OncomiR数据库分析宫颈癌患者中miR-665是低表达的(图7-A、7-B)。K-M软件分析发现高表达miR-665的患者生存率更好(图7-C)。TCGA和GEPIA数据库分析宫颈癌患者中DRAM1是高表达的(图7-D、7-E)。K-M软件分析发现高表达DRAM1的患者生存率不良(图7-F)。StarBase数据库分析发现宫颈癌患者中miR-665与DRAM1的表达水平呈负相关关系(图7-G)。

注：A: TCGA数据库分析miR-665在宫颈癌中水平;B: OncomiR数据库分析miR-665在宫颈癌中水平;C: K-M软件分析宫颈癌患者的生存曲线;D: TCGA数据库分析DRAM1在宫颈癌中水平;E: GEPIA数据库分析DRAM1在宫颈癌中水平;F: K-M软件分析宫颈癌患者的生存曲线;G: StarBase数据库分析宫颈癌患者中miR-665与DRAM1的相关关系图7 生物信息学预测宫颈癌中miR-665与DRAM1的关系

3 讨论

miRNA是一类小的非编码的相对保守的RNA，长度为18-25个碱基，通常能够抑制蛋白的表达或者降解其靶基因的mRNA。很多证据证明，miRNA介导的基因的转录后修饰能够调控很多生活学功能，如炎症、血管形成、纤维化修复、凋亡及宫腔粘连[12]。最近的研究报道，miR-665作为一个抑制性的因子能够失活Wnt/β-catenin信号通路[13]。miR-665能够抑制宫颈癌细胞的增殖和转移能力[14]。我们发现miR-665在宫腔粘连中低表达的。过表达miR-665后，能够显著抑制hESC细胞的增殖能力，迁移能力和EMT进程。

DRAM1是一种进化上保守的跨膜蛋白，主要定位于溶酶体，并作为肿瘤蛋白p53(TP53)介导的自噬和程序性细胞死亡的靶点[15]。最近的报道表明，高水平的DRAM1与多形性胶质母细胞瘤(GBM)患者的总生存期较短有关，而DRAM1的敲低抑制胶质母细胞瘤干细胞(GSCs)的迁移和侵袭能力[16]。本研究发现DRAM1过表达后能促进EMT进程。另外，我们通过生物信息学软件分析发现miR-665在宫颈癌患者中是低表达的，且与患者生存率呈正相关。DRAM1在宫颈癌患者中是高表达的，且与患者生存率呈负相关。而且，miR-665与DRAM1的表达水平在宫颈癌中呈负相关关系。

总之，本研究发现miR-665通过靶定并调控DRAM1的表达抑制hESC细胞的增殖能力、迁移能力和EMT进程。miR-665也能缓解体内宫腔粘连的发生发展。因此，miR-665将可能作为一种新的策略用于治疗宫腔粘连。