丙烯酰胺染毒大鼠H反射的特征*

冯润荷， 张玺， 魏洁， 张引国

1天津医学高等专科学校生理学教研室(天津 300222)； 2温州医科大学眼视光学院(浙江温州 325035)； 3天津市公安局安康医院精神科(天津 300240)； 4武警后勤学院生理学与病理生理学教研室(天津 300309)

丙烯酰胺(acrylamide，ACR)是一种在工业领域内有广泛应用的化工原料，是一种公认的神经毒物和人类可能致癌物[1-2]。ACR除职业接触外，近年来发现在某些食品(如高温烹调的富含淀粉的食物)[3]和香烟中也含一定量的ACR单体，某些经过市政处理的饮用水中也含有微量的ACR单体，因此引起广泛的社会关注。ACR有较强的神经毒性，主要为感觉-运动型周围神经病[4]和中枢神经病变[5-6]。感觉障碍表现为深反射减弱或消失、共济失调、手足套袜型感觉障碍，肢端振动觉/位置觉减退等。运动障碍表现为肌肉无力、共济失调、腱反射的减退、肌肉张力常有不同程度的减退，甚至发生进行性肌萎缩和瘫痪。ACR导致的感觉-运动型周围神经病，其病理主要涉及周围神经轴索变性，继发性的髓鞘脱失，最后进入华勒变性，发生机制可能与细胞骨架蛋白的损害有关[7-8]。ACR导致的中枢神经病变突出表现在不同程度的意识障碍、精神症状和小脑共济失调，可能与突触前递质的释放减少及能量代谢障碍等有关[9]。ACR对机体的危害是很严重的，且无特效药，早期诊断并促进神经系统的修复是治疗本病的关键。H反射是一种电刺激诱发的脊髓反射，可反映脊髓单突触牵张反射的兴奋性、反射通路的完整性和可塑性及感觉-运动功能状态，被认为是临床上检测神经肌肉功能状态、运动损伤与恢复及评价药物康复治疗效果等的一个早期敏感指标[10-11]。H反射的条件易于控制，而且在体内多种肌肉上均能诱发出，这些特点也促使其在神经科学上的广泛应用。2018年3月至2019年9月，本研究观察了大鼠ACR不同染毒时间后其后肢H反射指标的变化，以期从脊髓反射的角度分析ACR中毒的机制，以进一步为ACR中毒的早期诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及处理 健康成年雄性SD大鼠64只，由中国人民解放军军事医学科学院动物所提供，许可证号：SCXK-(军)2012-0004。所有动物喂养过程中室温适宜[(20±2)℃]，湿度适宜，自由饮水取食。适应1周后将动物随机分为对照组和染毒组，每组各32只动物。再随机将每组各分为0、3、6和9 d亚组，共8个亚组，每个亚组8只动物。

1.2 给药方法及步态评分 染毒组以50 mg/kg的剂量腹腔注射ACR溶液[12]，1次/d，对照组同种方式注射生理盐水。染毒的第0、3、6和9天测取大鼠体重和评定步态分值。步态评分方法如下。将大鼠于空旷干净的地面上，使其自主活动，观察3 min。评分标准如下，1分：正常步态；2分：轻微异常步态(轻微共济失调，步态比较吃力，出现足外张)；3分：中度异常步态(有明显的共济失调，出现足外展或移动时肘外展)；4分：重度异常步态(出现足外展，整个身体无力支撑)[13]。

1.3 主要试剂与仪器 ACR纯度>99%(美国Genview公司)；RM6240生物机能实验系统由成都仪器厂生产。

1.4 H反射的测定 按30 mg/kg剂量，腹腔注射1.5%戊巴比妥钠作动物麻醉。实验大鼠俯卧位固定，以大鼠腘窝处作2～3 cm纵行切口，钝性分离股二头肌，暴露坐骨神经及其分支，然后向下分离出胫神经，以双极钩状银丝电极(直径0.6 mm)，作为刺激电极直接置于胫神经上，将记录电极插入大鼠后肢骨间肌(拇趾与食趾之间)[14]，参考电极插入其远端1 cm处皮肤作为辅极，同时将接地电极固定于鼠尾。时间常数0.01 s，高频滤波10 kHz。应用RM6240生物机能实验系统记录 H反射程序参数如下，以波宽0.2 ms的方波刺激，刺激强度从0开始逐渐增大。各组分别于腹腔注射的第0、3、6和9天测量体重及步态评分，并同步检测H反射的变化。

1.5 统计学方法 用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析(ANOVA)，组间比较采用LSD最小显著差法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 对照3 d亚组、染毒9 d亚组大鼠毛色光滑，情绪稳定，活动自如。而染毒组先后出现烦躁、激惹、被毛杂乱、活动减少、倦怠、震颤和摇摆。

2.2 大鼠的体重和步态 对照组体重从第0～9天稳定地增长，而染毒组体重从染毒第0～6天增长缓慢，且在染毒第9天体重不增反降。染毒组从染毒的第6天体重就开始下降，持续到染毒的第9天。步态结果显示染毒大鼠在染毒的第3天开始出现行走稍微不协调，双后足间距轻微加宽，染毒到6 d开始出现身体震颤，出现足外展，能够向前移动，染毒第9天后肢出现瘫痪，勉强向前移动时双后肢拖地，甚至不能支撑整个身体，而对照组大鼠步态一直稳定。见表1。

表1 大鼠不同时间的体重变化及步态评分

2.3 H反射的诱导及H反射的特征 所有大鼠在一定的强度下均能诱发出H反射。对于对照组而言，在最低刺激强度下首先出现H波，随着刺激强度的增大，M波才出现，即H波诱发的阈值低于M波诱发的阈值。另外，刺激强度由小到大时，M波幅度由小到大，而H波幅度由小到大再到小。对于染毒组而言，在染毒的第3天，H波和M 波诱发出现的顺序与对照组相同。在染毒的第6天组，有3只动物先诱发出M波后诱发出H波，即部分H波诱发的阈值高于M波诱发的阈值。在染毒9 d组，所有动物在最低刺激强度下先诱发出M波，随着刺激强度的增大，再诱发出H波，即H波诱发的阈值均高于M波诱发的阈值，呈现H波和M波诱发出现的顺序的完全颠倒(图1)。

注：A：对照组；B：染毒组；右侧的数据为实际诱发的电流强度图1 两组第9天从大鼠后肢骨间肌诱导的典型H反射图

在染毒的第3天，H波阈值明显增高(P<0.05)，但H波潜伏期、Hmax、M 波阈值与潜伏期及Mmax与对照组第3天比较均差异无统计学意义(P>0.05)。在染毒第6天，H波阈值明显继续增高(P<0.01)，同时Hmax明显减小(P<0.05)；H波潜伏期、M波阈值和潜伏期及Mmax无明显变化(P>0.05)。在染毒的第9天，H波和M波各项指标均发生了改变，表现为H波(P<0.01)和M波(P<0.05)阈值均增大，Hmax(P<0.01)和Mmax(P<0.05)明显减小及H波(P<0.05)和M波(P<0.01)潜伏期延长。对照组各天H反射的各指标均无明显变化。见表2。

表2 两组H反射的诱导及H反射的特征

3 讨论

H反射由Hoffmann得名，感受器是肌梭，是电刺激胫神经诱发的脊髓单突触牵张反射。H反射研究的是感觉传入、运动传出、效应器(骨骼肌)和脊髓神经元池的整个活动。Ia型粗大的有髓纤维为传入神经纤维，α运动纤维为传出神经纤维。正常情况下，当刺激强度较低时，低阈值的Ia型粗大的有髓纤维先兴奋，产生H波，当刺激强度增大到足以引起阈值较高的α运动神经元兴奋时则会产生M波，此时继续增大刺激强度，H波将逐渐减小而M波达到最大[15]。H反射中，H波和M波各参数的意义不同。H波的潜伏期反映反射弧兴奋传递的时间，其潜伏期可以反映整个反射通路的传导时间即反射时[16]。H波幅度与整个反射通路的完整性有关。H 波的刺激阈值与Ia型粗大的有髓纤维兴奋性或敏感性有关。M 波的潜伏期反映兴奋经过运动单位(由α运动神经元、其所支配的骨骼肌和神经肌肉接头共同构成)的传递时间，即神经肌肉复合动作电位的潜伏期，与神经肌肉复合动作电位的传导速度有关。M波幅度与整个运动单位的完整性有关，反映了神经肌肉复合动作电位的幅度。M波的刺激阈值与运动单位的兴奋性或敏感性有关。

ACR中毒是一种重要的职业性疾病，通过动物模型模拟染毒过程可以为临床提供有价值的资料。在本研究采用的模型中，大鼠ACR染毒9 d就可造成急性中毒模型[12]。H反射相关指标的变化最早发生在染毒的第3天。在染毒的第3天，H反射的H波阈值就增大了，而H波的潜伏期、Hmax与M波的阈值、潜伏期及Mmax均无明显变化。这提示在染毒的第3天，H反射的反射弧中低阈值的Ia型粗大的有髓传入纤维兴奋性已经降低。在ACR染毒的第6天，除H波阈值增大外，Hmax也降低，推测H反射的反射弧已部分开始损伤。在ACR染毒的第9天，M波和H波各项指标均发生了明显变化，且H波诱发的阈值高于M 波诱发的阈值，推测H反射的反射弧或反射通路的损伤进一步加剧，已涉及到由α运动神经元由α运动神经元、其所支配的骨骼肌和神经肌肉接头三者共同构成的运动单位。

H反射是脊髓反射机能的重要指标，但同时受高位中枢的调控，特别是高位中枢对该反射有一定的突触前抑制作用[17]。一般认为，当高位中枢损害后，脊髓失去上运动神经元的抑制作用后兴奋性增加，往往导致脊髓单突触反射增强或亢进[10,18]。近年来的大量研究表明，ACR中毒可导致多个高位中枢(如大脑皮层、脊髓、小脑、纹状体等)损伤[19-21]。而本研究中发现H反射从染毒的第6天开始就明显减弱，因此可以进一步印证丙烯酰胺染毒损伤了H反射的推测。

ACR染毒大鼠H反射的反射弧或反射通路的改变，与染毒后体重的变化及体态评分相适应。伴随着染毒时间的增加，ACR在体内的累积剂量增大，大鼠体重下降的明显，体态评分也越高，H反射的指标改变愈广泛愈显著。提示H反射的反射通路的改变与ACR染毒的严重程度有一定的关联性。ACR染毒大鼠H反射的改变可能与外周神经损伤变化的趋势一致，即先损伤感觉传入神经，后损伤运动传出神经。特别有意义的是在染毒的第3天伴随着大鼠步态评分增大的同时，通过H反射就可以检测到H波的阈值增大了，这提示H反射可以作为评价ACR中毒的一个早期指标。

H反射是一种非常有用的工具，在神经肌肉功能评价等方面有独特的作用[22]。结合ACR对周围感觉和运动神经损伤的机制及损伤的顺序(感觉神经损伤先于运动神经)，推测染毒大鼠H 反射减弱的病理生理机制可能如下：ACR先降低低阈值的Ia型粗大的有髓传入纤维的兴奋性，再损伤低阈值的Ia型传入纤维，进一步损伤α运动神经元和其所支配的骨骼肌共同构成的运动单位。H反射有望作为评价ACR中毒的一个早期敏感指标。未来的研究需进一步证实。