LMP2A调节EBV相关胃癌细胞中PD-L1的表达

吴烜 童刚领 程勃然 余少康 王树滨

【摘要】 目的 探討膜潜伏蛋白2A（LMP2A）调节EB病毒（EBV）相关胃癌（EBVaGC）细胞中程序性死亡蛋白-配体1（PD-L1）的表达， 并分析LMP2A和PD-L1在胃癌细胞株中的表达及关系。方法 选取人胃癌细胞株SNU-719[EBV阳性（EBV+）]、AGS[EBV阴性（EBV-）]， 采用实时荧光定量聚合酶链式反应 （qRT-PCR）方法检测胃癌细胞株SNU-719（EBV+）及AGS（EBV-）中LMP2A和PD-L1基因的表达水平， 佛波醇（TPA） 诱导SNU-719（EBV+）和AGS（EBV-）中LMP2A的表达后， 蛋白质印迹法（WB）检测LMP2A、PD-L1蛋白表达水平的变化。结果 PD-L1在EBV阳性细胞株SNU-719（EBV+）中的表达水平明显高于在AGS（EBV-）中的表达水平， 差异具有统计学意义（P<0.05）。SNU-719（EBV+）中LMP2A mRNA转录水平明显高于AGS（EBV-）细胞株， 差异具有统计学意义（P<0.05）;AGS（EBV-）、SNU-719（EBV+）细胞株中PD-L1和LMP2A mRNA转录水平具有一致性。诱导12、24、48 h， LMP2A在SNU-719（EBV+）细胞株中表达呈上升趋势， 而AGS（EBV-）细胞株无变化。TPA诱导12 h后， SNU-719（EBV+）细胞PD-L1表达明显升高， 而AGS（EBV-）细胞株升高不明显。结论 EBV相关胃癌可能通过LMP2A介导的致癌途径上调PD-L1表达， 从而引起肿瘤免疫逃逸。这提示阻断LMP2A致癌途径和PD-1/PD-L1检查点抑制通路可为EBV感染的胃癌患者带来潜在临床益处。

【关键词】 EB病毒相关胃癌;膜潜伏蛋白2A;程序性死亡蛋白-配体1;免疫治疗

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.24.087

【Abstract】 Objective   To discuss the expression of programmed death protein ligand 1 （PD-L1） in EB virus associated gastric cancer （EBVaGC） cells by latent membrane protein 2A （LMP2A）， and analyze the expression and correlation between LMP2A and PD-L1. Methods   Human gastric cancer cell lines SNU-719 [EBV positive （EBV+）] and AGS [EBV negative （EBV-）] were selected. Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） was used to detect the expression of LMP2A and PD-L1 in gastric cancer cell line SNU-719 （EBV+） and AGS （EBV-）. Then the cells were induced with phorbol-12-tetradecanoate-13-acetate （TPA）， Western blotting （WB） was used to detect the expression levels of LMP2A and PD-L1. Results   The expression level of PD-L1 in EBV positive cell line SNU-719 （EBV+） was significantly higher than that in AGS （EBV-）， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The transcription level of LMP2A mRNA in SNU-719 （EBV+） was significantly higher than that in AGS （EBV-） cell lines， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The transcription levels of PD-L1 and LMP2A mRNA in AGS （EBV-） and SNU-719 （EBV+） cell lines were consistent. At 12， 24， and 48 h after induction， the expression of LMP2A in SNU-719 （EBV+） cell line showed an upward trend， while the expression of AGS （EBV-） cell line remained unchanged. After 12 h of TPA induction， the expression of PD-L1 in SNU-719 （EBV+） cells was significantly increased， while that of AGS （EBV-） cell lines was not significantly increased. Conclusion   EBV associated gastric cancer may upregulate the expression of PD-L1 through LMP2A-mediated carcinogenic pathway， resulting in tumor immune escape. These findings indicated that simultaneous inhibition of PD-1/PD-L1 and LMP2A may provide potential survival benefits to patients with EBV associated gastric cancer.

【Key words】 EB virus associated gastric cancer; Latent membrane protein 2A; Programmed death protein ligand 1; Immunotherapy

胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。在我国， 胃癌的发病率和病死率居高不下， 位居我国恶性肿瘤发病率为第2位， 死亡率位居第3位， 发患者数及死亡人数均占全球胃癌发病总例数的50%左右[1， 2]。尽管早期胃癌的治疗预后较好， 5年无病生存达70%以上， 然而临床Ⅲ～Ⅳ期患者在综合治疗后仍容易复发和转移， 复发、转移性胃癌中位生存时间只有9～10个月[3]。除了20%的胃癌患者具有人表皮生长因子受体-2（HER-2）扩增可以应用靶向治疗外， 其他类型的胃癌目前尚缺少明确有效的靶向药物， 临床急需探索新的高效、低毒的药物。2014年， 癌症基因组图谱计划的研究者将胃癌分为4种基因亚型[4]， 其中一类亚型为EB病毒（epstein-barr virus， EBV）阳性胃癌也称EBVaGC， 根据既往研究报道， 全球范围内EBVaGC发病率为3.3%～26.3%， 其中以东亚占比最多[5]。最近研究发现EBVaGC有一个非常明显的病理特征：癌细胞周围浸润了大量的淋巴细胞， 但是并不能识别及清除癌细胞， 呈现典型的肿瘤免疫逃逸状态[6]。分子研究显示， EBV潜伏感染及其产生的潜伏期蛋白LMP2A是EBVaGC发生恶性转化及免疫逃逸的主要原因之一[7]。进一步研究发现， 免疫负性调节蛋白PD-L1在EBVaGC组织中亦有广泛表达[8]， 提示PD-L1/2拮抗剂可能成为此型胃癌患者的治疗新选择。目前， 关于LMP2A及PD-L1相关性未有文献报道。因此， 本研究拟于体外研究中探讨EBVaGC中PD-L1与LMP2A的表达情况， 并探讨其之间相互作用关系。现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 细胞株 人胃癌细胞株SNU719（EBV+）、AGS（EBV-）由香港中文大学肿瘤学系李晨博士赠予。

1. 2 材料与试剂 总RNA提取试剂盒、qRT-PCR试剂、Lipofectamine 2000、胎牛血清、RPMI-1640培养基、β-actin对照单克隆抗体购于承启医学（深圳）科技有限公司;TPA佛波醇购于上海生工;Anti-PD-L1抗体、Anti-EBV LMP2A抗体购于深圳市亿立方生物技术有限公司。

1. 3 实验方法

1. 3. 1 细胞培养、TPA诱导LMP2A表达 SNU719（EBV+）、AGS（EBV-）在含10%胎牛血清和抗生素（10000 U/ml青霉素和10 μg/ml链霉素）的RPMI1640培养基中培养， 置于37℃、5%CO2的加湿培养箱中。TPA诱导LMP2A在胃癌细胞株SNU-719（EBV+）和AGS（EBV-）中的表达， 诱导时间分别为12 h、24 h、48 h。

1. 3. 2 qRT-PCR检测胃癌细胞株中LMP2A及PD-L1 mRNA表达水平 采用总RNA提取试剂盒进行RNA提取， 纯度合格后逆转录成cDNA。设计引物：PD-L1上游引物CCAGTCACCTCTGAACATGAA， 下游引物ATTGGTGGTGGTGGTCTTAC;LMP2A上游引物ATGACTCATCTCAACACATA， 下游引物CATGTTAGGCAAATTGCAAA。

1. 3. 3 蛋白质印迹法（Western blotting， WB）检测PD-L1、LMP2A蛋白表达情况 按蛋白提取试剂盒说明提取总蛋白， 高温变性。样品SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜， 用5%milk/PBST室温封闭1 h后孵育一抗[anti-PD-L1（1∶500）、anti-LMP2A（1∶500）]， 4℃冰箱过夜。将PVDF膜放入用5%milk/PBST稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗中， 室温摇床孵育1 h。显影后用Image J软件分析蛋白条带灰度， 以目的蛋白/内参蛋白灰度值进行分析。

1. 4 统计学方法 采用SPSS23.0统计学软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验;计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 PD-L1在AGS（EBV-）及SNU-719（EBV+）细胞株中的表达 PD-L1在EBV阳性细胞株SNU-719（EBV+）中的表达水平明显高于在AGS（EBV-）中的表达水平， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2. 2 PD-L1、LMP2A mRNA在AGS（EBV-）及SNU-719（EBV+）细胞株中的表达 SNU-719（EBV+）中LMP2A mRNA转录水平明显高于AGS（EBV-）细胞株， 差异具有统计学意义（P<0.05）;AGS（EBV-）、SNU-719（EBV+）细胞株中PD-L1和LMP2A mRNA转录水平具有一致性。见图2。

2. 3 TPA诱导后PD-L1、LMP2A在AGS（EBV-）及SNU-719（EBV+）细胞株中的表达 诱导12、24、48 h， LMP2A在SNU-719（EBV+）细胞株中表达呈上升趋势， 而AGS（EBV-）细胞株无变化。TPA诱导12 h后， SNU-719（EBV+）细胞PD-L1表达明显升高， 而AGS（EBV-）细胞株升高不明显。见图3。

3 讨论

肿瘤的治疗已经进入了免疫治疗的时代。然而不同于黑色素瘤、肺癌等免疫原性较强的肿瘤， 胃癌免疫原性相对较弱， 异质性较高， 总体来说， 免疫治疗在胃癌有效率并不高， 找到适合免疫治疗的胃癌亚群尤为重要。EBVaGC是胃癌中一特殊亚型， 病理表现为花斑状， 肿瘤周围有免疫细胞浸润， 而癌细胞最终可以逃避宿主的免疫消除并继续生长， 分子研究显示其伴随JAK2、PD-L1与PD-L2基因的扩增[7]， 提示该亚型存在着肿瘤微环境免疫抑制并可能成为靶向免疫检查点治疗的潜在人群。然而， 目前对于EBVaGC中PD-L1调节的潜在机制及其临床意义仍然知之甚少。在本研究中， 胃癌细胞株中PD-L1的表达（无论是在蛋白水平还是在mRNA水平）都与EBV感染呈正相关。这一结果与既往一些病毒相关癌症的研究相似， 如EBV相关淋巴瘤[9]以及流行区的EBV相关鼻咽癌[10]， HBV相关肝细胞癌[11]中亦发现PD-L1表达的上调。而其他病原体， 如幽门螺杆菌， 也被报道能诱导胃癌细胞系PD-L1的表达[12]。这些研究表明， 感染相关的肿瘤可以通过上调PD-L1来创造一个“免疫豁免”的环境。因此， 靶向PD-L1/PD1通路以阻断免疫抑制可成为该类肿瘤的重要治疗策略。近期韩国一项研究对61例接受PD-1抑制剂pembrolizumab的转移性胃癌患者进行了疗效分析和基因检测， 结果显示， EBV陽性的患者有效率为100%[13]， 为最特异的疗效相关指标。

本研究進一步探讨了EBV感染鼻咽癌中PD-L1上调的可能机制。既往研究表明， 致癌驱动基因可上调PD-L1， 引起肿瘤免疫逃逸， 有报道， 在非小细胞肺癌（NSCLC）中， 致癌的EGFR信号通路可能触发PD-L1的表达， 从而导致免疫耐受[14]。而以往研究也表明， EBV主要致癌基因LMP1可通过激活STAT3、AP-1、 NF-κB通路介导鼻咽癌中PD-L1的上调[15]。胃癌中， LMP2A在一半以上的EBVaGC中表达， 与致癌途径的启动相关。本研究中， PD-L1在EBV（+）细胞系中的表达与LMP2A呈正相关， 此外还发现， 通过外源性诱导LMP2A过表达， 能显著增加PD-L1的表达。因此， LMP2A参与激活的致癌途径至少是EBV相关胃癌PD-L1上调的部分原因。LMP2A这一新发现的功能可能为EBV驱动的胃癌的免疫逃逸和肿瘤发生提供新的见解。本研究同时也存在一定的局限性：①未能进一步探索LMP2A驱动PDL1表达的分子机制;②其结果基于体外研究， 有待体内模型及更多基础研究进一步验证。

综上所述， EBVaGC可能通过LMP2A介导的致癌途径上调PD-L1表达， 从而引起肿瘤免疫逃逸， 有利于理解EBV介导的肿瘤生成及免疫逃逸机制， 有助于临床更好的筛选接受免疫治疗的胃癌人群， 从而扩大治疗获益;同时也提示阻断LMP2A致癌途径和PD-1/PD-L1检查点抑制通路可为EBV感染的胃癌患者带来潜在临床益处。

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[收稿日期：2020-05-06]