肺腺癌组织FGL1表达及其对肺腺癌放射敏感性的影响

刘嘉庆 龙焕屏 于洋洋 李光

(中国医科大学附属第一医院放疗科，辽宁 沈阳 110001)

肺腺癌通常表现出不同程度的放射抵抗性，导致其放射治疗效果欠佳〔1～3〕。如何提高肺腺癌的放射敏感性是目前放疗领域急需解决的问题。纤维蛋白原样蛋白(FGL)1是主要在肝脏中衍生表达的一类生长因子。研究表明，FGL1在非小细胞肺癌(NSCLC)中表达上调，被认为具有一定的致癌效应〔4〕。FGL1与NSCLC免疫治疗的预后有关，其表达水平可预测程序性细胞死亡(PD)-1/配体(L)1抑制剂疗效〔4〕。FGL1可影响细胞周期，而细胞周期与细胞内在的放射敏感性密切相关〔5〕。有关FGL1在肺腺癌中的表达及作用的研究并不多，FGL1对放疗的影响目前尚未见报道。本文拟分析FGL1表达及其可能对肺腺癌的放射敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 A549细胞购自沈阳海灵兴业商贸有限公司；质粒购自吉凯基因；FGL1引物、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Takara逆转录和实时聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购自宝日医生物技术北京有限公司；NEOFECTTMDNA转染试剂购自北京码因科技有限公司。

1.2人肺腺癌组织样本的选择 选取在中国医科大学附属第一医院胸外科手术的肺腺癌患者的24例癌和癌旁组织标本。男10例，女14例，年龄48～69岁，平均(57.12±3.24)岁。

1.3人肺腺癌细胞系的培养 配置含有10%胎牛血清、1%双抗的RPMI1640培养液，将A549细胞置于含有5% CO2的37℃恒温细胞培养箱中培养。

1.4转染 按照说明书要求，利用助转染试剂将FGL1沉默(shRNA#1/#2)及沉默对照(NC-shRNA)质粒转染入A549细胞中。

1.5RT-PCR FGL1正向引物5′-CTTTTGCAGGAGAATGAAGTCC-3′，反向引物5′-CTCTGAACAATCTGCATACTGC-3′；β-actin正向引物5′-CCAGACAGCACTGTGTTGGCATA-3′，反向引物5′-ATGTTGCCCTAGACTTCGAGCAAG-3′。使用2-ΔΔCt方法计算倍数变化。

1.6克隆形成实验 在6孔板中根据剂量梯度接种不同数目的细胞，过夜培养后分别给予0，2，4，6，8 Gy的电离辐射；继续培养10 d后，用磷酸盐缓冲液清洗细胞，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色；计数克隆，根据单击多靶模型绘制剂量-存活曲线。

1.7统计学分析 利用GraphPad Prism7.00进行t检验。

2 结 果

2.1FGL1在肺腺癌及癌旁组织中的表达差异 16例肺腺癌组织FGL1含量比癌旁组织高；肺腺癌FGL1含量(11.100±19.333)明显高于癌旁组织(1.000±0.000，P<0.05)。

2.2A549细胞中FGL1沉默效果 转染shRNA#1和shRNA#2的A549细胞中FGL1含量分别为0.524±0.154和0.494±0.072，显著低于转染NC-shRNA的A549细胞(1.000±0.000；P<0.01和P<0.001)。

2.3沉默FGL1对肺腺癌细胞放射敏感性的影响 克隆形成实验获得的克隆和A549细胞剂量-存活曲线见图1，转染shRNA#1和shRNA#2的A549细胞平均致死剂量(D0)、准阈剂量(Dq)、离体肿瘤培养细胞经过2 Gy照射后细胞存活分数(SF2)均显著低于转染NC-shRNA的A549细胞(P<0.05)；转染shRNA#1和shRNA#2的A549细胞的放射增敏比(SER)均大于1。见表1。

图1 克隆形成实验检测沉默FGL1对A549细胞放射敏感性的影响

表1 A549细胞剂量-存活曲线参数

3 讨 论

放疗联合靶向、免疫、化疗等方式可显著改善晚期NSCLC患者的预后，并具有增敏免疫疗效的作用〔6,7〕。据统计，约有64%的NSCLC患者在治疗的不同时期接受过放疗〔8〕。放疗主要通过电离辐射诱导DNA双链断裂并抑制DNA修复，有效杀伤或杀灭肿瘤细胞，降低患者的肿瘤负荷，其疗效主要取决于肿瘤细胞的放射敏感性〔9〕。然而，随着放疗在NSCLC治疗中的普及，出现了不少对放疗不敏感的现象，这种放疗抵抗在肺腺癌中尤为明显，导致其放疗效果欠佳〔1～3,10〕。目前对NSCLC放疗抵抗的研究多集中在细胞周期阻滞与DNA修复、DNA损伤修复基因表达、肿瘤微环境的影响等方面〔11,12〕。

在某些肿瘤中，FGL1的表达变化可以改变细胞周期〔5〕。在胃癌的研究中，FGL1与肿瘤的转移及预后密切相关，但不同瘤种中FGL1的表达和作用可能存在差异〔13,14〕。

本文结果显示，FGL1在肺腺癌中的表达显著高于癌旁组织，与Wang等〔4〕研究结果相一致，验证了FGL1在NSCLC中表达上调。通过癌症基因组图谱(TCGA)的进一步在线分析也提示FGL1在其他肿瘤，包括乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌和结直肠癌中均有高表达，提示其在肿瘤发生发展中的普遍作用〔4〕。D0越小，肿瘤细胞的放射敏感性越高；Dq体现了肿瘤细胞积累亚致死性损伤的能力，等同于克服剂量存活曲线肩区所需要的剂量；SF2能够反映肿瘤细胞的放射敏感性；SER是沉默对照与沉默组肿瘤细胞的D0之比，SER大于1表示沉默组相较于沉默对照组起到了放射增敏的效果。本结果表明沉默FGL1可以显著降低A549细胞对辐射的抵抗力。

综上，FGL1在肺腺癌组织中表达上调，沉默FGL1可以增加肺腺癌的放射敏感性。FGL1有可能成为肺腺癌患者放射治疗的新靶标。