茄子秆生物炭联合黑麦草对土壤镉-芘复合污染修复的影响

李桂荣，陈富凯，贾胜勇，王宗硕，郭泽楠

(1.郑州大学 生态与环境学院，河南 郑州 450001； 2.郑州大学 水利科学与工程学院，河南 郑州 450001；3.河南省城乡规划设计研究总院股份有限公司，河南 郑州 450044)

重金属镉(Cd)和多环芳烃(PAHs)均属于土壤中最具代表性、分布最广的污染物，给农作物的产量以及人类健康带来严重威胁[1-4]，同时，土壤Cd和PAHs复合污染物能够在不同程度上影响或改变生态环境，使土壤生物种类和数量减少，给生态环境带来严重的危害和安全隐患[5]。近年来，由于生产管理粗放，污染物排放超标，土壤作为污染物的最终受体，其环境质量受到严重影响。因此，针对土壤重金属和PAHs复合污染物的修复不仅是国际环境研究的热点问题，也是中国土壤环境所面临的紧迫任务。

国内外学者对于土壤重金属Cd和PAHs治理修复开展了大量研究。徐宏婷等[6]研究了电动-氧化修复对污染物去除的影响，结果表明，少量重金属可通过电迁移的方式被移出土壤，而PAHs可被电动输送的氧化剂氧化去除。刘利军等[7]考察了添加硫磺、酵素菌、生石灰、纳质膨润土、腐植酸、硅藻土、CXEM菌剂对春玉米籽粒及土壤中Cd、PAHs含量的影响，结果表明，污染去除效果主要与土壤改良剂自身性质有关，其中CXEM菌剂使土壤PAHs含量降低了17.8%，但对Cd含量影响不大。邵承斌等[8]研究认为，将黑麦草与蚯蚓联用可有效去除污染土壤Cd与多环芳烃蒽，并且通过提高微生物活性来促进植物对混合污染土壤的修复。另外，土壤Cd和PAHs污染对土壤微生物群落生态会造成影响，当污染物的量超过土壤自净能力时，能使土壤生态系统失调[9-11]。

上述研究所涉及的方法、条件控制要求严格，应用成本高，操作过程复杂。近年来，生物炭作为物理修复技术被广泛应用于污染土壤修复[12-18]。生物炭由生物质在隔氧或无氧环境下经热裂解后产生，具备易制备、无污染、高稳定性等优点，并且生物炭可使土壤中PAHs降解细菌群落结构和多样性均发生显著变化[19]，其多孔结构能够促进PAHs降解，并且降低重金属的生物可利用性[20-21]。大气污染治理要求秸秆禁止焚烧，而制备生物炭为其寻求到一个资源化出路，可以变废为宝，实现以废治废。另外，生物炭作为一种有机肥料被广泛使用，其含有丰富的氮、磷、钾等营养物质，能够促进植物生长发育和根际活性。而黑麦草是一种高效富集Cd和降解芘(Pyrene)的植物，生物炭联合黑麦草对去除土壤Cd-Pyrene复合污染可发挥协同促进作用。

河南省是南水北调水源地和全国重要的粮食生产核心区，土壤环境形势不容乐观。针对土壤Cd和PAHs的治理已经迫在眉睫，急需开发一种环境适应性强、修复性好、无二次污染的生态修复技术。本研究以复合污染土壤的重金属Cd和PAHs(Pyrene)为研究对象，以茄子秆为原料制备新型生物炭并进行表征，考察在一定污染物程度、生物炭添加量的条件下Cd-Pyrene复合污染物去除效果，构建生物炭联合黑麦草生态技术修复Cd-Pyrene污染土壤，揭示茄子秆生物炭联合黑麦草对Cd-Pyrene复合污染土壤微生物多样性及群落变化的影响，为土壤Cd-Pyrene复合污染物去除及揭示土壤微生物群落结构变化规律提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 材料

供试土壤和茄子秸秆采自河南郑州某农田，土壤基本性质列于表1，标记为S1；Cd-Pyrene复合污染土壤采用芘和硝酸镉进行人工配置，使土壤中Cd、Pyrene含量分别达到16.8、71.04 mg/kg，标记为S2。土壤经自然风干，过筛，备用。

表1 土壤的基本理化性质Tab.1 The basic physical and chemical properties of soil

1.2 生物炭的制备

采用限氧裂解的方法制备茄子秸秆生物炭，首先对风干后的茄子秸秆原材料进行适当破碎处理，并在烘箱烘干。取茄子秸秆于马弗炉中在无氧环境中加热至500 ℃，保温3 h制得生物炭，放入干燥器皿之中，其基本性质：pH值为10.7，产率为28.62%，灰分为9.2%。

1.3 生物炭对Cd与Pyrene的去除

取生物炭5 g(粒径3～5 mm)与S2土壤100 g均匀混合于250 mL玻璃烧杯，反应过程中每隔15 d对土壤进行取样(生物炭和土壤质量比为1∶20)，分离所取生物炭和土壤，土壤样品风干后测定土壤Cd、Pyrene含量，每个试验设置3组重复，并设无添加生物炭组作为空白对照组(CK)，试验周期60 d。整个过程用去离子水使土壤含水量保持在田间最大持水量的60%左右。

1.4 生物炭联合黑麦草对Cd与Pyrene的去除

取4 kg的S2土壤铺设于花盆(长30 cm、宽15 cm、高20 cm)并种植黑麦草(种植密度为13.5 mg/cm2)，以无生物炭投加试验组为T1，设置生物炭投加量分别为10、30、50 mg/g，分别标记为T2、T3、T4。每个试验设置3组重复，培养周期55 d。试验期间用去离子水使土壤含水量保持在田间最大持水量的60%左右。采集黑麦草样品用自来水清洗干净，并用去离子水漂洗3次，置于90 ℃干燥箱中烘至恒质量，测定黑麦草生物量以及Cd、Pyrene含量，在黑麦草植株采集区同步采集根际土样品，风干后测定Cd、Pyrene含量。

1.5 生物炭及生物炭联合黑麦草对土壤微生物群落结构和多样性的影响

采用恒温水浴烧杯(250 mL)反应的方法，设置4个不同土样处理：200 g S1土壤、200 g S2土壤、200 g S2土壤投加6 g 生物炭；200 g S2土壤投加6 g 生物炭并种植黑麦草(种植密度与1.4中相同)，分别标记为OS(Original soil)、CS(Co-contaminated soil)、CS+BC(Co-contaminated soil with biochar)、CS+BCEP(Co-contaminated soil with biochar enhancing plant ofRyegrass)，期间保持土壤含水率为田间最大持水量的60%，温度设置30 ℃，培养30 d后取土样进行高通量测序测试。

1.6 测定项目及方法

1.6.1 生物炭的微观形貌特征 生物炭的微观形貌特征采用聚焦离子束扫描电镜(Zeiss Auriga FIB SEM)进行观察。将ES 500生物炭样品干燥后固定在导电胶上，经喷金后在5 kV的电压下进行测试。

1.6.2 土壤和植物中Cd含量 黑麦草样品预处理用硝酸-高氯酸(1∶4)进行消化，土壤样品采用盐酸-硝酸-氢氟酸-高氯酸(2∶3∶2∶1)进行消化。消化完全后用盐酸(3%)溶液定容，经0.45 μm水相滤头过滤后用火焰原子吸收分光光度计(普析，TAS-990)测定Cd含量。测定过程进行空白试验，土壤和植物中Cd的加标平均回收率分别为96%(n=3，RSD<4.3%)和87%(n=3，RSD<7.8%)，土壤重金属Cd去除率(R)的计算公式为：

(1)

式中，C0为土壤重金属Cd初始含量，Ct为土壤重金属Cd测试含量。

1.6.3 土壤和植物中Pyrene含量 在2 g土壤样品加入10 mL二氯甲烷进行超声萃取1 h，在3 000 r/min下离心10 min，取上清液过自制硅胶柱(内径1 cm)，并用50%(v/v)正已烷和50%(v/v)二氯甲烷混合液15 mL进行洗脱，收集液体转移至旋转蒸发仪蒸至近干后用氮气吹干，最后用甲醇(色谱纯)定容。

在0.25 g植物样品加入50%丙酮(v/v)和50%正已烷(v/v)混合液10 mL进行超声提取30 min，在3 000 r/min下离心10 min，收集连续提取3次的上清液过自制硅胶柱(内径1 cm)，并用50%(v/v)正已烷和50%(v/v)二氯甲烷混合液15 mL进行洗脱，收集的液体转移至旋转蒸发仪蒸至近干后用氮气吹干，最后用甲醇(色谱纯)定容。以上样品处理液用0.22 μm尼龙滤头过滤后，采用高效液相色谱仪(安捷伦，Agilent 1100)分析测定。测定过程进行空白试验，土壤和植物中Pyrene的加标平均回收率分别为94.5%(n=3，RSD<3.5%)和85%(n=3，RSD<8.4%)，土壤Pyrene去除率(P)的计算公式为：

(2)

式中，D0为土壤Pyrene初始含量，Dt为土壤Pyrene测试含量。

1.6.4 土壤微生物群落结构和多样性 土壤微生物群落结构和多样性利用高通量测序进行分析。利用欧米茄试剂盒(E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit，M5635-02)提取土壤中的DNA并进行钝化。利用测序平台(Illumina MiSeq)以细菌16S rRNA V3—V4区特征性引物341F(CCCTACACGACGCTC

TTCCGATCTG(barcode)CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R(GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC)进行聚合酶链反应(PCR)扩增，扩增体系(50 μL)如下：预混液2×TapMaster Mix 15 μL；正向引物Primer-F(10 μmol/L)1 μL；反向引物Primer-R(10 μmol/L)1 μL；基因组DNA(20 ng/mL)3 μL；无核酸酶水30 μL。每个样本进行3个重复，并将同一样本的PCR产物进行混合。根据数据库(silva119，http://www.arb-silva.de/)中的核糖体序列比对，利用mothur软件(http://www.mothur.org/)将有效序列按照97%相似性进行操作分类单元(OTU)聚类，并去除采样和测序过程中携带的可疑OTU序列，得到OTU代表序列。生物炭及生物炭联合黑麦草对土壤微生物群落结构和多样性都是基于对OTU的分析得到的。对菌群的α-多样性指数进行计算，以Chao指数(http://www.mothur.org/wiki/Chao)、Ace指数(http://www.mothur.org/wiki/Ace)来反映。采用柱状图呈现微生物群落结构(在门、科、属水平)相对含量的变化情况。

1.7 数据处理与分析

用Excel 2010 数据分析软件进行试验数据处理，用Origin 软件制图，采用SPSS 22.0 进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 生物炭的基本性质及微观形貌特征

如图1所示，生物炭表面含有大量的孔状结构和较高的孔隙率，孔状结构逐层叠加，组成管道型结构，侧壁纤薄并有排列整齐的小孔，孔隙结构明显，孔径大小组成丰富。

A：200倍；B：2 000倍

2.2 生物炭对土壤中Cd、Pyrene的去除率

从图2可以发现，CK土壤中Cd和Pyrene均降解缓慢，表明Cd-Pyrene复合污染物具有较高的稳定性。生物炭可以显著促进复合污染Cd和Pyrene的去除，第60天Cd、Pyrene去除率分别达到21.88%、23.55%，较CK分别提高17.71%与14.28%，这主要与生物炭丰富的多孔结构和较大的比表面积有关，同时，生物炭对Cd和Pyrene降解菌的影响也发挥了重要作用。

2.3 生物炭联合黑麦草对土壤中Cd、Pyrene的去除率

生物炭可以显著提高黑麦草去除Cd、Pyrene的能力(图3)。经55 d的反应后，生物炭添加量为T2时，Cd、Pyrene的去除率分别达到17.92%和65.89%；添加量增至T3后，Cd和Pyrene去除率可进一步提高至20.59%与70.58%。然而，当生物炭的添加量继续增加至T4时，Cd和Pyrene去除率分别下降至17.21%与67.58%，因此，黑麦草对Cd、Pyrene去除率随生物炭添加呈先增加后减小趋势。T3对土壤Cd去除率显著高于T1、T2、T4，而T3、T4对土壤Pyrene去除效果显著优于T1。另一方面，对比投加生物炭去除体系和生物炭联合黑麦草去除体系对Cd、Pyrene去除率可以发现，Pyrene的去除效果要优于Cd。

图2 生物炭对土壤中Cd、Pyrene去除率的影响Fig.2 Effects of biochar on Cd and Pyrene removal rate in soil

从图4中可以发现，一定添加量的生物炭能够促进黑麦草生长。黑麦草生物量(干质量)在T3生物炭添加量下最高，达5.16 g/盆，继续增加生物炭投加量(T4)致使黑麦草生物量下降至3.94 g/盆，与T3相比生物量减少23.6%。

黑麦草体内Cd含量随生物炭添加量增加而减少，T1黑麦草体内Cd含量显著高于T2、T3、T4；Pyrene含量变化情况与Cd不同，随生物炭添加量呈先增加后减少趋势，T3和T4黑麦草体内Pyrene含量显著高于T1、T2。另外，黑麦草体内Pyrene含量为6.14～8.42 mg/kg，远低于Cd。

不同小写字母表示不同处理之间差异显著(P<0.05)，下同

图4 生物炭对黑麦草体内Cd、Pyrene含量的影响Fig.4 Effects of biochar on Cd and Pyrene content in Ryegrass

2.4 生物炭对土壤微生物多样性的影响

如表2所示，OS、CS、CS+BC和CS+BCEP不同土样的土壤微生物群落OTUs数量及其多样性指数(Chao、Ace指数)存在一定的差别。相对于OS，CS土壤Chao、Ace指数均有所降低，CS+BC土壤Chao、Ace指数较CS有明显提高。相较于CS，CS+BCEP土壤Chao指数变化不大，而Ace指数变化较大；相较于CS+BC，CS+BCEP土壤Chao、Ace指数均有所降低。

表2 不同土样土壤微生物OTUs数量及Alpha多样性指数Tab.2 The number of OTUs and Alpha diversity index of soil bacteria

2.5 生物炭对土壤微生物群落结构的影响

从不同水平(门、科、属)分析不同土壤微生物的OTUs所代表的物种分类信息，进一步揭示生物炭与黑麦草对Cd-Pyrene复合污染土壤微生物群落结构具体的影响，结果如图5—7所示。

如图5所示，4种土样在门水平上的主要优势物种基本相同，相对含量较高的前2种分别为变形菌门和酸杆菌门。其中，变形菌门在OS、CS、CS+BC和CS+BCEP的相对含量分别为42.40%、41.69%、46.04%、54.16%，表明添加生物炭和种植黑麦草能提高变形菌门的相对含量；而酸杆菌门在OS、CS、CS+BC和CS+BCEP的相对含量分别为19.15%、18.53%、17.65%、14.62%，意味着添加生物炭和种植黑麦草在一定程度上能抑制酸杆菌门的生长。同时，结果表明，Cd-Pyrene复合污染将对变形菌门和酸杆菌门细菌的生长产生抑制作用，导致其相对含量均有一定程度的减少。

图5 不同土样微生物群落相对含量变化(门水平)Fig.5 Variation of relative content of microbial communities in different soil samples (Phylum level)

由图6可知，OS、CS、CS+BC和CS+BCEP土壤在科水平下的优势菌种为鞘脂单胞菌科和芽单胞菌科，其在4种土壤中的相对含量分别为22.94%、20.05%、20.35%、18.76%和10.92%、8.56%、11.68%、7.55%,CS+BCEP土壤中假单胞菌科的相对含量为6.21%，与OS、CS和CS+BC相比，相对含量分别提高了124、103、62倍。

如图7所示，相较于OS，Cd-Pyrene、生物炭及黑麦草对微生物群落组成影响较小。OS、CS、CS+BC和CS+BCEP土壤在属水平下前2种菌属分别为鞘氨醇单胞菌和芽单胞菌，其在OS、CS、CS+BC、CS+BCEP土壤中的相对含量分别为17.15%、14.07%、15.29%、14.74%和8.44%、6.75%、9.37%、6.34%。相较于OS，CS土壤中鞘氨醇单胞菌相对含量减少3.08个百分点，CS+BC内相较于CS该菌相对含量增加1.22个百分点；相较于OS，CS土壤中芽单胞菌相对含量减少1.69个百分点，CS+BC使该菌相对含量明显提升，而CS+BCEP土壤中芽单胞菌的相对含量有一定的下降。另外，CS+BCEP较CS土壤中假单胞菌和肠杆菌的相对含量明显提升，假单胞菌提高160倍，肠杆菌提高414倍。

图6 不同土样微生物群落相对含量变化(科水平)Fig.6 Variation of relative content of microbial communities in different soil samples(Family level)

图7 不同土样微生物群落相对含量变化(属水平)Fig.7 Variation of relative content of microbial communities in different soil samples(Genus level)

3 结论与讨论

生物炭的孔隙结构能够吸附土壤污染物并为微生物生长提供了场所[22-23]，对去除土壤PAHs有主导作用[24]，因此，生物炭作为一种理想土壤Cd-Pyrene吸附去除材料具有天然的结构优势。王立果等[25]发现，生物炭能够对水中Cd-Pyrene有较强的吸附去除能力，本研究结果表明，添加生物炭同样能够显著提高土壤Cd-Pyrene去除率，其原因不仅与生物炭表面孔隙以及含氧官能团吸附土壤Cd-Pyrene有关[26]，还与生物炭添加后影响土壤微生物群落变化有关[27]。

生物炭作为一种有机肥料，含有丰富的矿物质及氮、磷、钾等营养元素，能够提供促进黑麦草生长所需养分和改善其生长的土壤环境。本研究结果表明，生物炭添加量在一定范围内能够促进黑麦草生长，使其生物量增加，但添加量超过一定范围会产生抑制作用，这与张明月[28]当生物炭添加量过多会对黑麦草的生长会产生抑制作用的研究结果一致，其原因可能是较高的生物炭添加量会影响黑麦草营养物质的吸收，从而影响植物发育生长。本研究中，添加生物炭对Cd-Pyrene的去除效果均有一定的提高，且Cd和Pyrene去除率随生物炭添加量增加呈先增加后减小趋势，这与黑麦草生物量变化情况类似，说明生物炭联合黑麦草对Cd、Pyrene的去除率与黑麦草生长有密切的联系。黑麦草作为一种高效富集重金属和PAHs的植物，对土壤Cd和Pyrene有着很好的吸收和去除能力[29-30]，生物炭通过促进黑麦草生长，进而影响生物炭联合黑麦草协同去除Cd和Pyrene的效果。Pyrene的去除效果要优于Cd，这是由于土壤微生物作用所致，有研究发现，Pyrene能够经土壤微生物转化，在形态上发生变化[31]。黑麦草体内Cd含量随生物炭添加量增加而减少，生物炭的添加对黑麦草Cd的吸收产生了抑制作用，这是由于生物炭对Cd活性产生了影响，对其产生钝化作用所致。本研究中，T3Cd去除率较T1(无添加生物炭)提高，表明生物炭联合黑麦草后对土壤Cd的去除具有协同作用。另外，黑麦草内Pyrene含量远低于Cd，这是因为Pyrene被黑麦草吸收后能够转化，而且黑麦草的根际效应可显著促进土壤中微生物对Pyrene的降解，生物炭的孔隙结构影响土壤持水与通气能力，促进降解Pyrene菌的生长，并为其提供生长所需碳源。因此，生物炭联合黑麦草对Pyrene有协同降解作用。

Cd和Pyrene污染导致土壤微生物群落结构和多样性发生变化，本研究中，土壤Cd和Pyrene污染致使微生物丰富度减少，说明土壤Cd-Pyrene对土壤中的微生物有一定的毒害作用。有研究发现，微生物群落结构受到重金属显著影响，并与重金属元素含量呈极显著正相关[32]，与本研究结果一致。Cd-Pyrene复合污染土壤中添加生物炭(200 g土壤添加6 g生物炭)明显提高了土壤微生物群落的丰富度，这与李航等[33]的研究结果一致，原因可能与生物炭中含有更多易被微生物降解的有机物有关，添加生物炭改善了微生物群落构成和代谢。相较于土壤单独添加生物炭处理(200 g土壤添加6 g生物炭)，即添加生物炭又种植黑麦草(200 g土壤添加6 g生物炭并种植黑麦草)对于土壤微生物群落的多样性影响相对较小，其原因可能是微生物生物量的积累与植物根系分泌物的释放有关[34]。

本研究对土壤微生物群落结构分析发现，添加生物炭和黑麦草能提高优势菌变形菌门的相对含量，这与任天宝等[35]的研究结果一致，原因是生物炭的有机碳源和多孔结构为微生物生长、代谢提供营养和空间。有研究证明，变形菌门对Pyrene有着较好的降解效果[36]，本研究发现，投加生物炭后土壤酸杆菌门生长受到抑制，这与生物炭呈碱性有关。本研究中，生物炭联合黑麦草处理下假单胞菌的相对含量明显提高，种植黑麦草后生长得到促进。有研究结果表明，假单胞菌是耐Cd细菌，对于吸附和积累Cd有很好的效果，有较强分解有机物的能力[37]。本研究发现，Cd-Pyrene会降低土壤鞘氨醇单胞菌相对含量，抑制其生长，添加生物炭后该菌相对含量明显提升，生物炭对其生长有促进作用。研究表明，鞘氨醇单胞菌既是耐Cd菌又对降解Pyrene有着独特的优势[38-39]，添加生物炭对于降解土壤Cd-Pyrene复合污染有重要促进作用。生物炭联合黑麦草处理下假单胞菌和肠杆菌的相对含量明显提升，这是因为黑麦草根系分泌物能够显著刺激假单胞菌和肠杆菌的生长，而生物炭具有丰富的有机碳和孔隙为其提供生长繁殖所需碳源和环境。有研究证明，假单胞菌和肠杆菌为耐Cd菌，并对PAHs有着较强的降解能力[37,40]，说明生物炭联合黑麦草对土壤Cd-Pyrene污染有较强的修复作用。