DMSO辅助浓缩气相色谱质谱联用仪测定水产品中6种丁香酚类化合物

余晓琴,方科益,邵 曼,李澍才,陈小泉,*

(1.四川省食品药品检验检测院,四川成都 610000;2.宁波海关技术中心,浙江宁波 315000)

丁香酚类为苯丙素类化合物,可以从丁香树、柴桂等多种植物中提取。主要包括丁香酚、甲基丁香酚、异丁香酚、甲基异丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙酰基异丁香酚等,具有麻醉[1-4]、抑菌[5]、抗氧化[6-7]等多种药理作用。随着人们生活水平的日益提高,对于水产品的需求,已经不只停留在关注水产品的种类上,同时对水产品的质量和鲜活度也提出了更高的要求。而丁香酚类化合物在渔用麻醉运输方面较其他的麻醉剂具有成本低、效果好以及残留期短的特点,近几年各国都有将其应用于渔业生产与活鲜水产品流通运输领域的报道[8-9]。丁香酚类化合物在我国作为允许使用的食品用合成香料(GB 2760,表B.3),执行GB 1886.129-2015 食品安全国家标准,可应用于很多食品中,但鲜水产在(GB 2760表B.1)不得添加食品用香料、香精的食品名单中,表明鲜水产不得使用丁香酚。美国国家毒理学计划(NTP)发布的毒理学数据显示,丁香酚类化合物对啮齿动物是致癌物或潜在的致癌物[1]。JECFA 规定丁香酚的ADI 为0～2.5 mg/kg bw[1]。

国内目前没有针对食品中丁香酚测定的国家或地方标准。查阅资料,有少量文献及研究报道水产品中六种丁香酚类药物的检测方法[10-11],主要有高效液相色谱法(HPLC)[12-13]、高效液相-串联质谱法(HPLC-MS)[14-15]、气相色谱法[16]及气相色谱-质谱联用法[17-21]。本研究综合目前文献报道方法中试样前处理方法开展预试验时,发现回收率不够理想甚至很低(部分方法回收率低至30%),逐步分析发现直接氮吹对目标化合物的回收率影响最大,采用氮吹浓缩时加入DMSO可降低其影响。为进一步摸底监测水产品中丁香酚类化合物使用情况,有必要建立准确稳定的检测方法。本文以鱼、虾为研究基质,采用气相色谱质谱法联用测定六种丁香酚类化合物,并开展实际样品测定,通过简单点暴露评估分析可能的风险隐患。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

标准品丁香酚(CAS No. 97-53-0)、甲基丁香酚(CAS No. 93-15-2)、异丁香酚(CAS No. 97-54-1)、顺式-甲基异丁香酚(CAS No. 93-16-3)、乙酸丁香酚酯(CAS No. 93-28-7)、乙酰基异丁香酚(CAS No. 93-29-8) 纯度均≥98%,上海安谱科学仪器有限公司;样品 在成都市多个农贸市场随机购买多种、多批次淡水鱼、海水鱼、淡水虾、海水虾,分别取鱼腹部位鱼肉和去壳后虾肉均质制样;乙腈、正己烷、二甲亚砜(DMSO) 色谱纯,美国Fisher公司;其他试剂 均为国产分析纯试剂。

Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪,配有电子轰击电离源(EI)、50 mL tubes陶瓷均质子 美国Agilent Technologies;T25 digital台式均质仪、MS3 digital涡旋振荡器 美国IKA公司;IDH30超声波清洗器 中国IRM公司;TurboVapLV氮吹仪 美国Biotage公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 分别准确称取6种丁香酚类化合物标准品100 mg(精确到0.1 mg),用乙腈溶解,并定容至100 mL,此标准储备溶液浓度约为1 mg/mL,4 ℃避光密封保存;将上述标准储备溶液用乙腈稀释制成0.01 mg/mL的混合标准中间溶液,4 ℃避光密封保存;用空白基质溶液将混合标准中间溶液制成浓度为40、100、200、500、1000 μg/L的标准系列工作溶液,临用时配制。

1.2.2 供试液制备 称取试样2 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,加入5 g无水硫酸钠,适当搅拌混匀,加入一颗陶瓷均质子和10 mL 乙腈,涡旋混匀1 min,超声提取15 min,5000 r/min离心5 min,取上清液;残渣中再加入10 mL乙腈重复提取一次,合并上清液;乙腈层中加入5 mL乙腈饱和的正己烷,涡旋振荡1 min,5000 r/min离心5 min,弃去正己烷层;乙腈层加入50 μL的DMSO,40 ℃氮吹至近干,用乙腈定容至1 mL,混匀,用0.45 μm有机微孔滤膜过滤,供气相色谱-质谱联用仪分析。

1.2.3 GC-MS分析 气相色谱分离条件:DB-1701色谱柱(30.0 m×0.25 mm,0.25 μm);升温程序:初始温度100 ℃,保持1 min,以6 ℃/min升温至200 ℃,再以25 ℃/min升温至260 ℃,保持5 min;进样口温度:230 ℃;载气:氦气(纯度≥99.999%);流速1.0 mL/min;不分流进样;进样量1 μL[17-19]。

质谱条件:电子轰击电离源(EI),正离子扫描、选择离子监控(SIM)模式;电离能量70 eV;传输线温度260 ℃;离子源温度:230 ℃;溶剂延迟时间:6.00 min;各化合物定量及定性离子见表1。

1.2.4 方法验证 本研究在实验室内进行分析方法的验证。在空白基质提取液中添加系列混合标准工作液进GC-MS分析测定,以化合物的定量离子色谱峰面积为纵坐标,化合物添加浓度为横坐标进行线性回归,得到标准曲线方程。以信噪比(S/N)>3,采用空白基质加标并逐级稀释的方式确定方法的检出限(LOD);通过方法精密度和回收率确定方法的定量限(LOQ)。基质匹配标准曲线的范围为20～1000 μg/L。方法的准确度和精密度通过测定加标回收率评价,加标水平为0.02、0.04和0.10 mg/kg,每个浓度水平重复测定6次。

1.3 数据处理

采用美国Agilent Technologies公司的MassHunter工作站用于控制仪器、数据采集和结果分析,Microsoft Excel制图。

2 结果与讨论

2.1 供试液制备

2.1.1 提取溶剂选择 本研究考察了6种丁香酚类化合物经乙腈、甲醇、乙酸乙酯和乙醇分别提取后的回收率。结果(图1)显示:提取溶剂为乙酸乙酯时,回收率为40%～63%,提取效果较差;当提取溶剂为乙醇时,乙酰基异丁香酚的回收率低于50%;使用乙腈和甲醇提取时,6种丁香酚类化合物的提取效果较好,且乙腈较甲醇的提取效果更好,6种化合物的回收率均>75%,因此,最终确定乙腈作为样品提取溶剂。

图1 提取溶剂选择(n=6)

2.1.2 净化方式选择 本研究考察了乙腈饱和正己烷脱脂、GCB净化、QuEChERS净化等方式,结果(图2)显示:用乙腈饱和的正己烷脱脂的净化效果较好,6种化合物的回收率均大于80%;用GCB净化,异丁香酚的回收率均仅为50%,其余组分的回收率均大于80%;用QuEChERS(安谱净化包)净化,异丁香酚的回收率仅为60%、甲基丁香酚和乙酸丁香酚酯的回收率不足70%。因此,确定使用乙腈饱和的正己烷脱脂作为净化方式。

图2 净化方式选择(n=6)

2.1.3 氮吹的影响与DMSO的使用 样品经乙腈提取后,提取液体积较大,且乙腈不适合作为气相色谱的进样溶剂,为了进一步提高方法灵敏度,并将溶剂置换成正己烷,同时考虑大量样品同时操作的便利性,本研究中选择氮吹进行乙腈提取溶液的浓缩。首先考察了6种丁香酚类化合物(10 μg/mL,n=3)在常见温度40 ℃氮吹至干后的回收率,6种丁香酚类化合物的回收率为21.29%～63.27%(见表2)。6种丁香酚类化合物常温下均为液态,且沸点较低,结合实验结果显示,在常见40 ℃氮吹浓缩过程中,容易气化,导致不同程度的损失。

表2 不同DMSO加入量对回收率的影响(n=6)

为提高丁香酚类化合物在氮吹过程中的保留率,考虑加入DMSO,以提高回收率。DMSO沸点较高,与乙腈、正己烷互溶,并对各种化合物具有良好的溶解性;通过在提取液中加入微量的DMSO,可使化合物在加热氮吹过程中保留在DMSO中,减少氮吹过程中的气化损失,有效提高待测物的回收率。本研究考察不同DMSO加入量对氮吹的影响,结果表明随着加入量的增加,各组分回收率均有提高,当DMSO加入体积为50和100 μL时,回收率增加并不明显,综合考虑,氮吹前加入DMSO的量确定为50 μL。

2.2 色谱柱的选择

本研究对比了DB-5(30.0 m×0.25 mm,0.25 μm)及DB-1701(30.0 m×0.25 mm,0.25 μm)两种色谱柱对待测化合物的分离效果。如图3所示,采用DB-5柱时,峰形存在拖尾,且异丁香酚及甲基异丁香酚在自然界存在同分异构体,购置标准品中存在未纯化完全同分异构体,由于碎片离子接近,异丁香酚及甲基异丁香酚的同分异构体杂质会对甲基丁香酚和异丁香酚形成干扰,改变升温程序也无法完全分离。而采用DB-1701时,峰形对称,且可完全分离这两种标准品杂质峰。因此,选择DB-1701作为色谱柱。

图3 气相色谱柱的选择

2.3 基质效应考察

本研究采用相对响应值法对四种水产品基质的基质效应进行了考察,即通过计算基质标准曲线斜率和标准溶液曲线斜率之比,来评价基质效应的程度。计算公式如下:

ME=(k2/k1)×100

式中:k1标准溶液曲线斜率;k2基质标曲斜率。

一般来说,当ME 在80%～120% 之间时,表明基质效应在可接受范围内。结果显示四种基质中6种化合物均存在不同程度的基质效应(见表3),因此需采用基质曲线进行定量。

表3 6种化合物在4种基质中的基质效应

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围、检出限与定量限 在空白基质提取液中添加系列混合标准工作液进 GC-MS分析测定,以化合物的定量离子色谱峰面积为纵坐标,化合物添加浓度为横坐标进行线性回归,得到标准曲线方程。6种丁香酚类化合物在20～1000 μg/L浓度范围内均有良好的线性关系,相关系数r均>0.999(表4)。采用空白基质加标并逐级稀释的方式进行检出限确定,使检出限浓度时对应的目标物信号信噪比(S/N)大于3,兼顾各仪器的灵敏度和精密度水平,最终在保证线性良好、相对标准偏差<15%、绝大部分化合物回收率60%～120%之间的前提下确定定量限。最终确定6种化合物在各基质中的检出限均为0.01 mg/kg,定量限为0.02 mg/kg。

表4 6种丁香酚类化合物的标准曲线及相关系数

2.4.2 准确度与精密度 以淡水鱼、淡水虾、海水鱼和海水虾为基质,进行加标回收实验。按照定量限的1倍、2倍、5倍进行3水平添加试验,各浓度平行制样6份。准确度以加标水平的回收率进行评价,以测出量对理论添加量的百分比值计算平均回收率和精密度。由表5可见,6种化合物各添加水平的平均回收率为64.8%～110.9%,相对标准偏差均<15%,方法的准确度和精密度均基本满足定量分析的要求。

表5 6种丁香酚类化合物的回收率实验结果(n=6)

2.5 实际样品测定

采用上述建立的方法,对从市场购买的121个样本进行测定。共计35个样本中检出丁香酚类化合物,6种化合物中只有丁香酚被检出,检出率为28.9%(35/121),含量范围为0.009～7 mg/kg,平均含量为0.6 mg/kg。其中海水鱼检出率较高,检出率为58.5%(24/41),主要为石斑鱼、鲳鱼、多宝鱼、海鲈鱼、泥猛等品种。

2.6 暴露量评估

JECFA规定丁香酚的ADI 为0～2.5 mg/kg bw。结合本次检测数据和中国居民膳食指南(2016年版)中建议水产类消费量(每天40～75 g,以75 g计算);以检出率最高的海水鱼做暴露评估,海水鱼丁香酚检测结果以及消费量开展点暴露量评估,24个样本检出丁香酚,最低值8.7 μg/kg,最大值2211 μg/kg,平均值226 μg/kg;按照残留量最大值、平均值计算,每人(按成人体重60 kg计算)每天从海水鱼中摄入的丁香酚总量占JECFA推荐ADI的0.01%和0.1%,结合考虑清洗、烹饪等因素,表明对人体产生的安全风险极低。

3 结论

本实验结合参考文献报道方法,证实氮吹浓缩为回收率低的最大原因;针对这一问题优化样品前处理条件,在氮吹时加入50 μL DMSO,可减少氮吹过程中的气化损失,有效提高6种丁香酚类化合物检测的准确度和精密度,并且对分析系统不产生干扰;该方法操作简便,定性定量准确,适用于水产品中6种丁香酚类化合物的同时检测。通过对121个实际样品测定后发现,确实存在检出丁香酚的情况,检出率为28.9%,其中海水鱼相对突出,丁香酚检出率为58.5%;虽检出率较高,但经点暴露量评估,水产品中检出的丁香酚对人体产生的安全风险极低。