响应面法优化超高压提取枸杞多糖工艺

杨孝辉,郭 君

(湖南化工职业技术学院,湖北株洲 412004)

枸杞(Lyciumbarbarum)是我国传统的药食同源植物[1],含有丰富的多糖[2]、维生素、植物黄酮、生物碱等物质,枸杞多糖具有抗氧化、免疫调节、抗癌、降血糖、降血脂[3]、抗衰老[4]、抗炎镇痛[5]等作用,从枸杞中提取多糖,对充分利用枸杞资源、促进枸杞产业的发展具有重要意义。

多糖的研究和开发是目前的研究热点之一,人们采用各种方法提取枸杞多糖[6-7]。水提醇沉法[8-10]是普遍使用的方法之一,工艺简单、易操作,但提取温度高,加热时间长,易使提取的多糖转化变质,降低纯度。超声波辅助法提取枸杞多糖的提取温度低,能较好保持多糖生物活性,但相对其他方法,提取效率低[11-12]。微波辅助提取法适宜于热敏性物质的提取,并具有高效、快速的特点,但可能存在多糖的降解,同时其设备的特殊性导致该方法较难用于工业化规模生产[13-14]。酶解法提取条件温和,产品的收率和纯度都较高,但高昂的生产成本限制了其工业化大规模生产[15-16]。超高压提取技术是近年发展较快的提取技术,具有提取速度快、低耗能、高效率、无污染、条件温和、易操作等优点,能够在快速、完全提取有效成分的同时保持提取物的生物活性。魏炜等[17]采用超高压提取技术对黄精多糖的提取工艺进行了优化,并将实验结果与传统水提取工艺进行对比,结果显示超高压提取法较传统水提取法的多糖提取率提高了5.18%。目前未见采用超高压提取枸杞多糖的相关文献报道。

本研究采用超高压提取技术,以枸杞多糖得率为考察指标,考察提取压力、保压时间、提取温度、液料比四个因素的影响,利用响应面分析法对枸杞多糖的提取工艺进行优化,以期为枸杞多糖的进一步研究和开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枸杞 产地宁夏;D-无水葡萄糖标准品(纯度﹥99.9%) 中国食品药品检定研究院;苯酚 天津市永大化学试剂有限公司;硫酸 成都市科龙化工试剂厂;乙醚、无水乙醇、硫酸亚铁、双氧水 天津市富宇精细化工有限公司;L(+)-抗坏血酸 广州化学试剂厂;实验所有试剂均为分析纯；实验用水均为新制二次蒸馏水。

L2-600/2型超高压处理设备 天津华泰森淼生物工程技术股份有限公司;UV-2550型紫外可见分光光度计 岛津制作所;AUW220D型分析天平 岛津制作所;SF-130型中药粉碎机 中南制药机械厂;DHS-20A自动快速水分测定仪 上海力辰仪器科技有限公司;WGL-45B型电热鼓风干燥箱 天津泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 枸杞多糖的提取工艺 取去除杂质的枸杞在50 ℃的电热鼓风干燥箱中干燥至含水量小于2%,粉碎、过60目筛,用10倍量无水乙醚(W/V)浸提3 h脱脂,重复3次,过滤,挥去枸杞样品中的乙醚,置硅胶干燥器中干燥,备用。称取经乙醚脱脂处理的枸杞样品10 g,以蒸馏水为提取溶剂,应用超高压提取装置提取枸杞多糖,提取液于30 ℃、-0.09 MPa条件下真空减压浓缩至含水量为40%的浓缩液,室温条件下往浓缩液中加入无水乙醇至溶液乙醇浓度达80%,5 ℃以下冷藏,静置12 h,过滤,将过滤得到的沉淀物置表面皿上,于20 ℃、-0.1 MPa条件下真空干燥后得枸杞粗多糖。

1.2.2 单因素实验 按照1.2.1方法萃取枸杞粗多糖,固定反应条件为提取保压时间5 min、提取温度45 ℃、液料比为20∶1 mL/g,考察不同提取压力(100、200、300、400、500 MPa)对多糖得率的影响;固定反应条件为提取压力400 MPa,提取温度45 ℃、液料比为20∶1 mL/g,考察不同保压时间(1、3、5、7、9 min)对多糖得率的影响;固定反应条件为提取压力400 MPa、保压时间7 min、液料比为20∶1 mL/g,考察不同提取温度(25、35、45、55、65 ℃)对多糖得率的影响;固定反应条件为提取压力400 MPa、保压时间7 min、提取温度55 ℃,考察不同液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g)对多糖得率的影响。进行单因素实验,考察各因素变量对枸杞多糖得率的影响。

表1 响应面分析因素及水平

1.2.4 葡糖糖标准曲线的绘制 准确称取干燥至恒重的无水葡萄糖标准品0.50 g,配成浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖对照品贮备液,从中分别精密吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于25 mL具塞试管中,各加水至1.0 mL,各加5%苯酚溶液1.5 mL,振摇混匀,滴加浓硫酸5.0 mL,迅速振摇均匀,于50 ℃下放置30 min,取出后冷却至室温,紫外可见分光光度法于490 nm波长下测定吸光度值[18],得标准曲线:y=0.3812x+0.0026,R2=0.9995,在0～100 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

1.2.5 枸杞多糖的测定 精密称取枸杞多糖适量,按照1.2.4方法显色并测定吸光度值,由标准曲线计算枸杞粗多糖质量,然后计算枸杞多糖得率。

多糖得率(%)=(枸杞粗多糖质量/枸杞样品质量)×100

1.2.6 枸杞多糖对·OH的清除能力测定 取试管,分别准确加入0.2 mol/L pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液2.0 mL和1.5 mmol/L邻二氮菲溶液1.0 mL,振摇,混匀,分别准确加入1.0 mL 1.5 mmol/L的硫酸亚铁溶液,1.0 mL浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的枸杞多糖样品溶液,振摇,充分混匀,再分别加入1.0 mL质量分数为0.01%的双氧水。调整反应体系体积为6 mL,放置37 ℃的恒温水浴锅中保温反应1 h,取出,用紫外可见分光光度计在536 nm波长处测定吸光度,测定数值记为AX。用1.0 mL水代替样品溶液,同法操作,记录测定数值A1,记为损伤组;用2.0 mL水代替样品溶液和双氧水溶液,同法操作,记录测定数值A0,记为未损伤组。以L(+)-抗坏血酸(VC)作为参照物[19-20],计算枸杞多糖样品对·OH的清除率。

·OH清除率(%)=[(AX-A1)/(A0-A1)]×100

式中:AX为样品组吸光度;A0为未损伤组吸光度;A1为损伤组吸光度。

近年来，晚霜、倒春寒、冰雹等自然灾害都会导致樱桃减产甚至绝收。其中，倒春寒导致樱桃花期授粉受精不良，每年樱桃损失约20%的产量；雹灾在果实膨大接近成熟期时危害樱桃果实，可导致15%～85%的樱桃受损；成熟期遇阴雨天气，可导致近20%的樱桃果实采前落果和裂果。虽然全区一直在增强对基地建设的支持力度，但绝大多数果园投入侧重于保证樱桃苗木的定植成活，少有果园在机耕道、生产便道、小水窖及其他必要农机的配套上实现相对完善，严重影响樱桃果实采收后的运输，增加了果品种植和采收成本，降低了种植户的经济效益，削弱了抵御自然灾害的能力。

式中:A0为未加枸杞多糖溶液反应的吸光度;A1为加枸杞多糖溶液反应的吸光度。

1.3 数据处理

数据分析采用Design-Expert.V8.0.6进行试验设计和数据处理。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 提取压力对多糖得率的影响 由图1可知,当提取压力从100 MPa增加到400 MPa时,枸杞多糖的提取得率从2.54%增加到8.75%,并在400 MPa压力时出现最大值;之后随着提取压力继续增加,枸杞多糖提取得率降低。这是因为压力增大,细胞变形破裂度升高,溶剂对枸杞颗粒的浸润速度加快,细胞内的多糖溶出加快;但压力过大,枸杞细胞破裂度加大,大量杂质从细胞内溶出,影响枸杞多糖的溶出[25],同时压力过大也可能会破坏多糖结构[26]。因此,提取压力选择为400 MPa。

图1 提取压力对枸杞多糖得率的影响

2.1.2 保压时间对多糖得率的影响 由图2可知,当保压时间从1 min增加到7 min时,枸杞多糖的得率从4.31%增加到9.18%,并在7 min时出现最大值;这是因为保压时间的延长使溶剂和溶质接触更加充分,枸杞多糖的提取得率增加;但保压时间超过枸杞多糖的耐受时间后,枸杞多糖分子结构受超高压作用而破坏,枸杞多糖提取得率下降。因此,保压时间选择为7 min。

图2 保压时间对枸杞多糖得率的影响

2.1.3 提取温度对多糖得率的影响 由图3可知,在25～55 ℃范围内,随着温度的升高,枸杞多糖得率从5.55%提升到8.68%,这是由于枸杞多糖在水中的溶解度随温度的升高而增加。同时,温度升高加快了枸杞多糖分子的热运动,枸杞多糖的溶出和转移加快;在55～65 ℃范围内,枸杞多糖得率随温度升高降低,这可能是由于温度超过55 ℃后,大量的杂质溶出,吸附了部分多糖,导致多糖得率降低。因此,提取温度选择为55 ℃。

图3 提取温度对枸杞多糖得率的影响

2.1.4 液料比对多糖得率的影响 由图4可知,液料比在10∶1～20∶1 mL/g范围内增加,枸杞多糖得率从6.48%升高到8.23%,这是由于溶剂用量增加,溶质浓度差加大,利于多糖溶出;液料比超过20∶1 mL/g后,溶质已溶出完全,溶剂增加,枸杞多糖得率趋于平缓。同时,过量的溶剂会导致后续浓缩工作量加大。因此,液料比选取20∶1 mL/g。

图4 液料比对枸杞多糖得率的影响

2.2 响应面试验结果

2.2.1 试验方案及结果 通过响应面法对超高压提取枸杞多糖的提取压力、保压时间、提取温度、液料比4个因素进行设计,试验方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果

采用Design-Expert.V8.0.6软件对数据进行回归拟合,得枸杞多糖得率Y对各因素回归方程为:Y=9.07+1.08A+0.43B+0.21C+0.37D-0.100AB+0.060AC+7.5×10-3AD-0.015 BC+0.077BD+0.028CD-1.15A2-0.53B2-0.50C2-0.36D2

表3 回归模型与方差分析

2.2.3 交互作用分析 图5a～f表示各影响因素两两作用对枸杞多糖得率的交互影响。由得到的各影响因素交互作用的响应面3D图和等值线可知,在所选范围内各影响因素的相互作用存在极大值,既是响应面的最高点,同时也是等值线最小椭圆的中心点。由表3数据分析可知,提取压力、保压时间、提取温度、液料比等影响因素的两两交互作用不显著(P>0.05)。

图5 各因素交互作用对枸杞多糖得率的影响

2.2.4 最佳条件的预测及验证实验 通过建立的模型预测枸杞多糖的最佳萃取工艺为:提取压力445.91 MPa、保压时间7.8 min、提取温度57.5 ℃、液料比22.93(mL/g),理论多糖得率为9.54%。考虑到操作的实际情况,将最佳工艺条件修订为:提取压力446 MPa、保压时间8 min、提取温度58 ℃、液料比23 (mL/g),在此工艺条件下进行验证实验,做重复试验3次,枸杞多糖得率平均为9.52%,与预测值9.54%误差为0.21%,表明该模型能够模拟和预测枸杞多糖的萃取,模型可靠。

2.3 枸杞多糖对·OH的清除能力测定结果

由图6可知,在0～1.0 mg/mL浓度范围内,枸杞多糖对·OH的清除率随浓度的增加而增加,当枸杞多糖浓度为1 mg/mL时,对·OH的清除率可达76.98%,抗坏血酸浓度为1 mg/mL时对·OH的清除率为93.65%,相同浓度下,枸杞多糖对羟自由基的清除能力低于抗坏血酸。

图6 枸杞多糖对羟自由基的清除能力

2.4 枸杞多糖对超氧阴离子自由基的清除能力测定结果

图7 枸杞多糖对超氧阴离子自由基的清除能力

3 结论