乙醇硫酸铵双水相萃取黄秋葵叶中的叶黄素

李 诺,钟秋平,陈文学,陈卫军,陈海明,云永欢

(海南大学食品科学与工程学院,海南海口 570228)

叶黄素是一种含氧类胡萝卜素,可增强机体免疫力,具有抗氧化性,能够保护人体免受自由基的损害[1-3]。人体自身无法合成叶黄素,只能从食物中获取,特别是从绿色和黄色的水果蔬菜中获得[4]。饮食中叶黄素的摄入可显著降低糖尿病和胰腺癌的发病率[5]。叶黄素是婴儿和儿童视觉和认知发展的重要调节剂,并在预防和治疗与早产有关的疾病方面发挥重要作用[6]。热带农业科学院热带作物品种资源研究所栽培的十几个品系黄秋葵初步测定,黄秋葵叶片中含有丰富的叶黄素和β-胡萝卜素,叶黄素的理想纯产量最高达到9261.7 g/hm2[7]。而具有高附加值的黄秋葵叶常作为鸡饲料的添加剂以增强鸡的着色强度,高附加值没有得到很好的体现[8]。目前黄秋葵叶的研究主要集中在品质分析方面,鲜有对黄秋葵叶叶黄素提取及抗氧化活性方面的报道。

随着叶黄素需求的增加,叶黄素受到了广泛的关注,因此迫切需要开发一种经济有效的提取方法来获得高产量的叶黄素。从天然植物资源中提取叶黄素的传统方法包括有机溶剂萃取法、超临界流体萃取法和酶法等[9]。有机溶剂萃取法虽操作简单,但萃取耗时长、成品残留污染,应用于食品、饲料等比较受限[10]。而超临界流体萃取提取产品纯度高,但操作繁琐,且成本较高,不适用于工业的扩大生产[11-12]。而由两种不同的聚合物或有机物与盐组成的双水相萃取系统利用简单的设备及温和条件下的简单操作即可获得较高的得率,具有环境生物相容性好、成本低、易于规模化生产等优点,可以替代传统的有机溶剂萃取法[13]。双水相萃取法在生物工程、药物分析、色素提取等方面取得了一些阶段性的成果,有着广阔的应用前景[14],因此,利用双水相萃取法提取叶黄素在工业生产中具有可行性和实用性。本试验通过单因素结合响应面的方法确定黄秋葵叶叶黄素提取的最佳条件，以期为黄秋葵的进一步加工利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

黄秋葵叶 由海口芝烨农业科技有限公司提供;叶黄素标准品 上海源叶生物科技有限公司;硫酸铵 分析纯,上海源叶生物科技有限公司;无水乙醇 分析纯,西陇科学股份有限公司;所用水 均为超纯水。

AR124CN电子天平 奥豪斯仪器有限公司;SK5200HP超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司;KH-45A电热恒温干燥箱 康恒仪器有限公司;TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 双水相体系相图制作 参照Huang等[15]的方法稍作修改,采用浊点滴定法制作乙醇-硫酸铵双水相相图。在含有一定浓度的硫酸铵溶液的试管中逐滴加入无水乙醇,直至溶液变浊,并记录无水乙醇的量。根据30 ℃乙醇浓度和盐浓度的记录数据,绘制乙醇-硫酸铵双水相相图。

1.2.2 叶黄素粗提液的制备 准确称取0.3 g冻干粉碎后的黄秋葵叶粉末,以1∶20 (g/mL)料液比加入无水乙醇,53 kHz超声波超声15 min,5000 r/min离心10 min,取上清液即叶黄素粗提液,备用。

1.2.3 双水相萃取工艺 称取一定量乙醇、硫酸铵、叶黄素粗提液、超纯水于小烧杯中,总质量为10.00 g,将该双水相体系振荡30 s并静置10 min,两相分离时收集上相中的叶黄素,测定相比R和叶黄素的含量,并计算其分配系数K及得率Y[16],其中:

K=Ct/Cb

式(1)

叶黄素得率(mg/g)=萃取液中叶黄素质量(mg)/黄秋葵叶粉末的质量(g)

式(2)

式中,Ct表示顶相的叶黄素浓度,μg/mL;Cb表示底相的叶黄素浓度,μg/mL。

1.2.4 单因素实验 选择质量分数分别为5%的粗提液(即取0.5 g按1.2.2的方法制备的粗提液加入到10.00 g乙醇-硫酸铵双水相体系中混合而成)和25%硫酸铵,分析质量分数为12%、14%、16%、18%、20%的乙醇对黄秋葵叶叶黄素萃取效果的影响;固定乙醇质量分数为14%,其他条件不变,分析质量分数为21%、23%、25%、27%、29%的硫酸铵对萃取效果的影响;固定乙醇和硫酸铵的质量分数分别为14%和27%,其他条件不变,分析质量分数为3%、4%、5%、6%、7%的粗提液对萃取效果的影响。

1.2.5 Box-Behnken试验 根据单因素实验结果,设计由硫酸铵质量分数、乙醇质量分数和粗提取液质量分数组成的三因素三水平17个组合的Box-Behnken实验,以得率为响应值确定黄秋葵叶叶黄素萃取的最佳提取条件,选取的试验因素和水平见表1所示。

表1 Box-Behnken 设计因素水平设计

1.2.6 超声辅助萃取叶黄素的动力学研究 分别测定萃取温度为303、308、313 K时超声辅助萃取叶黄素粗提液的动力学曲线,并确定相关反应级数。根据等温条件下的动力学公式

dW/dt=k(Wmax-W)n

式(3)

对式(3)进行积分,得到式(4)和式(5)

[Wmax1-n-(Wmax-W)1-n]/(1-n)=kt+a(n≠1)

式(4)

ln[Wmax/(Wmax-W)]=kt+a(n=1)

式(5)

式中:Wmax表示一定温度下最大产物得率,mg/g;W表示在萃取时间t时的产物得率,mg/g;k表示萃取表观速率常数;t表示萃取时间,min;a表示积分常数;n表示萃取反应级数。

1.2.7 叶黄素含量测定 准确称量一定量的叶黄素标准品,在不同的25 mL棕色容量瓶中用无水乙醇准确制备浓度分别为5、10、15、20和25 μg/mL的叶黄素标准溶液。放置10 min后,用紫外可见分光光度计在445 nm下测定样品的吸光度,同时以空白试剂为参照,绘制标准曲线方程:y=0.0354x+0.0082,R2=0.9996。其中,x是溶液中叶黄素的浓度,μg/mL;y是吸光度值。

1.2.8 抗氧化性评价 将黄秋葵叶叶黄素浓度稀释为0.25、0.5、1、2、4 mg/mL,然后进行DPPH自由基和ABTS自由基清除能力试验。

1.2.8.1 DPPH自由基清除能力测定 参照魏华等[17]的方法略有修改,首先在517 nm下,用无水乙醇将0.2 mmol/L DPPH溶液的吸光度稀释至1.2～1.3。取4 mL配制的DPPH溶液与1 mL待测样品混合均匀,在517 nm的波长下测定样品的吸光值,并以等体积的无水乙醇替代样品作为对照组。DPPH自由基清除率计算公式:

DPPH自由基清除率(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式(6)

式中:A0表示未加样的DPPH的吸光值;A1表示样品与DPPH反应后的吸光值。

1.2.8.2 ABTS自由基清除能力的测定 参考范杨杨等[18]方法作适当修改,将0.2 mL 7.4 mmol/L的ABTS溶液与0.2 mL 2.6 mmol/L的过硫酸钾溶液混合,避光条件下贮存12～16 h,用PBS溶液将ABTS自由基溶液的吸光度稀释到0.70左右。取待测样品0.2 mL,加入上述溶液3.8 mL后摇晃10 s,避光6 min后在734 nm的波长下测定吸光值,同时用PBS溶液替代样品作对照。ABTS自由基清除率计算公式:

ABTS自由基清除率(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式(7)

式中:A0表示对照组的吸光值;A1表示样品的吸光值。

1.3 数据处理

单因素实验和响应面试验的结果分别采用OriginPro 8和Design-Expert.V8.0.6.1处理,所有试验均重复3次,取平均值。

2 结果与分析

2.1 乙醇-硫酸铵双水相体系的相图

由相图(图1)可知乙醇与硫酸铵须在一定的比例和较大的质量分数范围内才具有良好的成相能力[19]。由图1可以观察到曲线所划分的两个区域,曲线上方为两相区,其中上相为富乙醇水相,下相为富盐水相[20]。当盐的质量分数维持在较高水平时,随着乙醇浓度的不断增加,曲线会出现形成双水相体系的极值点,而过量的成相盐在乙醇浓度较高时也会析出。因此,在接下来的实验中,乙醇和成相盐的质量分数应首先从双峰曲线以上区域选取。

图1 乙醇-硫酸铵双水相体系相图

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇浓度对萃取效果的影响 如图2所示,乙醇质量分数在12%～14%的浓度范围内随着乙醇浓度的增加,叶黄素的得率也逐渐增加,在乙醇质量分数为14%(w/w)时有最大得率和分配系数。之后随着乙醇浓度的不断增加,得率和分配系数均呈下降趋势。可能是由于乙醇对水分子的竞争能力增强,使两相更容易分开[21],叶黄素更倾向于上相,上相体积随乙醇浓度的增加而增大,这有助于叶黄素在上相富集。但过高的乙醇浓度会导致盐沉淀[22]。因此,确定适宜的乙醇质量分数为14%。

图2 乙醇质量分数对叶黄素分配系数和得率的影响

2.2.2 硫酸铵浓度对萃取效果的影响 图3可以看出,叶黄素的得率和分配系数在硫酸铵质量分数为21%～27%(w/w)范围内随硫酸铵浓度的增加而增加,并在硫酸铵质量分数为27%(w/w)时达到最大值;当硫酸铵质量分数由27%上升到29%(w/w)时,二者开始下降。随着盐浓度的增加,硫酸铵与乙醇争夺体系中的水,导致水合能力增强,极性增大,上相体积减小,从而导致目标化合物的减少[23-24]。因此,适宜的硫酸铵质量分数为27%。

图3 硫酸铵质量分数对叶黄素分配系数和得率的影响

2.2.3 粗提液浓度对萃取效果的影响 由图4可知,在粗提液质量分数为6%时,叶黄素的得率和分配系数达到最大值,但随着浓度进一步增加,二者开始减小。其主要原因是粗提液质量分数为6%时,叶黄素在乙醇相中达到饱和,如若继续增加粗提液的浓度会造成原料的浪费[25],因此确定萃取粗提液的最佳质量分数为6%。

图4 粗提液质量分数对叶黄素分配系数和得率的影响

2.3 响应面结果分析

2.3.1 响应面结果及方差分析 响应面法是一种多变量优化实验的有效统计技术,以最少的运行次数确定最优工艺参数[26]。本实验采用Box-Behnken响应面法对萃取过程中的关键影响因素进行优化,结果见表2。将所得的实验数据进行多元回归拟合,得到以叶黄素得率(Y)对乙醇质量分数(A)、硫酸铵质量分数(B)和粗提液质量分数(C)的二次多项回归方程:

表2 Box-Behnken设计方案与结果

Y=1.96+0.075A+0.04B+0.035 C-0.055AB-0.04AC-0.03BC-0.13A2-0.042B2-0.063C2

为了检验方程的有效性,对乙醇-硫酸铵双水相萃取叶黄素的数学模型进行方差分析,结果见表3。由表3可知,P模型<0.001,表明模型极显著;失拟项P=0.5551>0.05,表明失拟项不显著,即所选的二次回归模型合理。模型决定系数R2=0.9142,说明模型拟合程度较好,可以充分反映各因素与响应值的真实关系。根据试验结果得出最佳条件:粗提液质量分数6.14%、乙醇质量分数14.40%、硫酸铵质量分数27.46%，得率为1.98 mg/g。由自变量F值大小可知,各因素对叶黄素得率的影响由大到小依次为乙醇质量分数>硫酸铵质量分数>粗提液质量分数,说明在提取过程中影响叶黄素得率的首要因素是乙醇质量分数,这可能与原料特性有关。

表3 Box-Behnken 试验结果的回归分析

2.3.2 响应面优化及模型验证试验 通过Design-Expert8.0.6.1软件对上述回归方程绘制响应面曲线如图5所示。通过响应面图即可对任意两因素对黄秋葵叶叶黄素得率的影响进行分析,从中确定最佳因素水平范围。根据实际操作,对最佳条件修正为粗提液质量分数6%、乙醇质量分数14.5%、硫酸铵质量分数27.5%,在此条件下,黄秋葵叶中叶黄素的平均得率可达1.99 mg/g。与模型预测值基本吻合,这能够有效说明该实验选用的模型是合理的。

图5 各因素交互作用的响应面图

2.4 提取动力学

萃取反应的动力学级数是提取动力学的重要参考依据,即当动力学曲线最接近直线时所对应的n值[27]。分别在不同温度下(303、308、313 K),改变萃取时间,获得不同温度下萃取叶黄素相应的最大产物得率和在萃取时间t时的产物得率。将n设为0.5、1和2,当n=l时,根据式(5)作图;当n=0.5和2时,根据式(4)作图。

如图6所示,当n=2时曲线最接近直线,故超声辅助萃取叶黄素符合二级动力学方程。

图6 反应级数曲线

2.5 黄秋葵叶叶黄素抗氧化性分析

由图7可以看出,叶黄素对DPPH自由基和ABTS自由基均有一定的清除作用。随着叶黄素浓度的升高,其对自由基的清除能力逐渐增强,但均弱于阳性对照VC。一般以清除率为50%的样品浓度IC50值来评价样品的抗氧化性,IC50值越小,样品的抗氧化性越强[28]。

图7 黄秋葵叶叶黄素以VC为对照时对ABTS自由基(a)和DPPH自由基(b)的清除率

由图7得到的拟合方程显示在表4中,当黄秋葵叶叶黄素对ABTS自由基和DPPH自由基的清除率为50%时,叶黄素的IC50值分别为0.2841和0.7633 mg/mL,故叶黄素对ABTS自由基的清除能力更强。该值比马娜等[29]盐析法萃取万寿菊花中的叶黄素清除DPPH自由基时的IC50值0.34 mg/mL大,说明从黄秋葵叶中提取的叶黄素对DPPH自由基的清除能力稍弱一些。

表4 叶黄素对不同自由基的IC50值

3 结论

通过单因素实验对影响双水相萃取黄秋葵叶中叶黄素的主要因素进行分析,根据单因素实验结果,选择较优水平设计Box-Behnken Design实验,通过响应面法优化提取的工艺条件,经回归方程方差分析及最优条件验证,并根据实际操作,对最佳条件修正为:粗提液质量分数6%、乙醇质量分数14.5%、硫酸铵质量分数27.5%,在此条件下,黄秋葵叶中叶黄素的平均得率可达1.99 mg/g,且叶黄素萃取过程符合二级动力学方程。影响叶黄素得率的首要因素是乙醇质量分数,这可能与黄秋葵叶自身特性有关。采用本方法提取的黄秋葵叶叶黄素以VC为对照,对DPPH自由基和ABTS自由基均有一定的清除作用,并根据IC50值的比较得知,叶黄素对ABTS的清除作用更强些。

实验表明利用乙醇-硫酸铵双水相萃取黄秋葵叶中的叶黄素,工艺稳定可行,操作简单,成本低,实验的重复性好,且适合放大生产。