溪蜜柚柚皮黄酮提取工艺优化

晏 幸,戴宇琪,欧丽明,胡 阳,2,3,魏好程,2,3,倪 辉,2,3,陈艳红,2,3,*

(1.集美大学食品与生物工程学院,福建厦门 361021;2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室,福建厦门 361021;3.厦门市食品生物工程技术研究中心,福建厦门 361021)

琯溪蜜柚(Citrusmaxima)是我国一种名优柚类植物,其果实营养丰富、肉质脆嫩、风味独特[1],在我国福建省、广东省、江西省等东南省份大量种植[2]。仅2016年福建省漳州市平和县种植面积就达4.33万公顷,年产量120万吨,产值超过50亿元[3]。随着琯溪蜜柚种植业及加工产业不断发展,产生了大量残次废果及加工副产物,亟待开发利用。柚皮富含黄酮类物质,柚皮是琯溪蜜柚残次废果及加工副产物的最主要构成。相关研究表明,来源于柚类等柑橘水果的黄酮类物质可作为天然食品添加剂、食用色素和风味改良剂[4],并且可防治心脑血管疾病、抗炎、抗过敏及预防糖尿病等[5]。因此,提取柚皮黄酮类物质是对琯溪蜜柚残次废果及加工副产物进行开发利用的重要途径。

柚皮黄酮类物质提取方法主要有水提法、碱提法、有机试剂提取法、超临界流体萃取、微波辅助提取法、超声波辅助提取法等[6-12]。不同的方法提取不同品种的柚皮中黄酮含量有一定的差别。吴志强等[13]采用表面活性剂协同微波提取胡柚皮中的总黄酮,得到胡柚总黄酮的提取率为4.35%。黄艺等[14]用微波提取沙溪蜜柚柚皮中总黄酮,总黄酮的提取率为0.272%。公衍玲等[15]采用星点设计-响应面优化乙醇提取化州柚柚皮总黄酮工艺,总黄酮得率为1.03%。其中,超声辅助提取法利用超声波辐射压强产生的机械效应、空化效应、和热效应共同破坏组织的细胞壁,加速物质扩散溶解,具有操作简单、提取时间短、提取量大、提取效率高等特点,是天然产物提取常见方法[16-18]。虽然部分研究优化了琯溪蜜柚的柚皮苷提取工艺[19],但目前尚没有对琯溪蜜柚果皮黄酮的提取工艺进行系统优化研究。对于提取工艺的优化,常用的方法包括单因素实验方法与多因素实验方法,其中,响应面分析法是一种常用多因素实验优化方法,可以通过少数试验和较短时间在二次方水平及各因子交互作用的角度优化工艺条件[20]。

基于以上研究背景,本研究采用超声波辅助法提取琯溪蜜柚柚皮的黄酮,综合运用单因素和响应面分析法优化工艺条件,为琯溪蜜柚总黄酮提取提供工艺参考,促进琯溪蜜柚残次废果及加工副产物的综合利用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

琯溪蜜柚柚皮 琯溪蜜柚购买于福建省漳州市平和县；芦丁(浓度≥95.0%) 国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇(分析纯) 上海沃凯生物技术有限公司;亚硝酸钠、九水合硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯 西陇化学股份有限公司。

JP-500C型高速粉碎机 永康市久品工贸有限公司;KQ5200DE型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;Epoch 2T型酶标仪 美国伯腾仪器有限公司产品;BS 124S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 柚皮黄酮提取工艺 实验前将琯溪蜜柚柚皮剥下,清洗干净,剪成1 cm2的小块,晒干至恒重,粉碎,过80目筛制成柚皮粉备用。精确称取2.00 g柚皮粉,以一定的液料比下加入一定浓度的乙醇溶剂,在一定的温度和一定的超声频率下超声提取一定的时间,趁热抽滤,收集提取液用超纯水定容至100 mL,此为得到的黄酮提取液。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 液料比对超声辅助提取柚皮黄酮的影响 称取2.00 g柚皮粉,以70%乙醇为提取溶剂,分别设定液料比为15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL/g,在超声温度30 ℃、超声功率160 W的条件下超声提取50 min,趁热进行抽滤,收集提取液用超纯水定容至100 mL,做三组平行实验,测定黄酮含量。

1.2.2.2 乙醇浓度对超声辅助提取柚皮黄酮提取的影响 称取2.00 g柚皮粉,在液料比30∶1 mL/g,提取时间50 min,提取温度为30 ℃,超声功率为160 W,分别采用10%、30%、50%、70%、90%的乙醇进行提取,样品超声后趁热进行抽滤,收集提取液用超纯水定容至100 mL,做三组平行实验,测定黄酮含量。

1.2.2.3 超声提取功率对柚皮黄酮提取的影响 称取2.00 g柚皮粉,以70%乙醇为提取溶剂,液料比30∶1 mL/g,提取温度为30 ℃,分别设定超声功率为120、140、160、180、200 W的条件下超声提取50 min,趁热进行抽滤,收集提取液用超纯水定容至100 mL,做三组平行实验,测定黄酮含量。

1.2.2.4 超声提取温度对柚皮黄酮提取的影响 称取2.00 g柚皮粉,以70%乙醇为提取溶剂,液料比30∶1 mL/g,设定提取温度为20、25、30、35、40 ℃、超声功率160 W的条件下超声提取50 min,趁热进行抽滤,收集提取液用超纯水定容至100 mL,做三组平行实验,测定黄酮含量。

1.2.2.5 超声提取时间对柚皮黄酮提取的影响 称取2.00 g柚皮粉,以70%乙醇为提取溶剂,液料比30∶1 mL/g,提取温度30 ℃,超声功率为160 W,超声提取时间分别为10、30、50、70和90 min,样品超声后趁热进行抽滤,收集提取液用超纯水定容至100 mL,做三组平行实验,测定黄酮含量。

1.2.3 响应面优化试验 采用Design-Expert 8.06软件的Box-Behnken设计原则设计试验。在单因素实验结果基础上,选取了乙醇浓度、超声功率、温度3个因素为优化参数,以黄酮提取率为响应值设计试验,试验因素和水平如表1。

表1 响应面试验因素与水平设计

1.2.4 总黄酮含量测定方法

1.2.4.1 标准曲线的绘制 精确称取 0.04 g芦丁标准品,置于100 mL容量瓶中,用30%乙醇溶解定容,制成浓度为0.40 mg/mL的标准品溶液。把0.40 mg/mL的芦丁标准品溶液用30%乙醇溶液稀释成0.00、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40 mg/mL不同的梯度浓度。取不同浓度的标准液各5 mL置于25 mL比色管中,向其中分别加入2 mL 30%乙醇溶液,充分摇匀,加入1 mL 5%的NaNO2溶液,混匀后静置5 min。再加入1 mL 10%的 Al(NO3)3溶液,混匀后放置5 min,然后加入10 mL 4% NaOH,摇匀,最后加入30%乙醇定容到25 mL,充分摇匀。混合后静置15 min。每组溶液在510 nm下的测定吸光度值。以芦丁标准液浓度(x)为横坐标,吸光度(y)为纵坐标绘制标准曲线,求得回归曲线方程线性回归方程:y=1.0685x+0.0356,R2=0.999。

1.2.4.2 提取液中黄酮提取率的测定 在“1.2.1”获得的黄酮提取液中取5 mL提取液于25 mL比色管中,按照“1.2.4.1”方法测得吸光度值,根据芦丁标准曲线按照式(1)计算提取液中黄酮的提取率。

式(1)

式中:C为由回归方程算得的样液浓度(mg/mL)；V1为测定时的定容体积(mL);V2为提取液定容体积(mL);M为称取样品的质量(g);V0为用于测定的提取液体积(mL)。

1.3 数据处理

通过Office Excel 2013(微软,美国)软件进行平均值、标准偏差的计算,折线图的绘制;通过Design-Expert 8.06软件的Box-Behnken设计原则进行响应面试验设计及数据分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 液料比对超声辅助提取柚皮黄酮的影响 不同的液料比对黄酮提取率的影响如图1所示,琯溪蜜柚柚皮黄酮提取率随液料比的升高而不断增加,当液料比30∶1 mL/g时黄酮的提取率达到最大值4.89%之后不再增加。出现这种情况可能因为溶剂用量的增加有利于黄酮物质溶解析出,但是随着扩散体系达到平衡时,继续增大溶剂量会增加杂质的浸出,其对提取率的增加效果减小[21-22]。

图1 液料比对黄酮提取率的影响

2.1.2 乙醇浓度对超声辅助提取柚皮黄酮的影响 不同的乙醇浓度对黄酮的提取率的影响如图2所示,随着乙醇浓度的增高,黄酮提取率先增大而后变小,在乙醇浓度为70%时黄酮提取率达到最大值4.83%。出现这种情况可能因为一开始乙醇浓度较低时,水的含量相对较高,使黄酮提取率较低。当黄酮提取率达到最大之后,继续增加乙醇浓度时,溶剂的极性变小,黄酮类物质溶解度降低,从而导致黄酮提取率降低[21]。

图2 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

2.1.3 超声提取功率对柚皮黄酮提取的影响 不同的提取功率对总黄酮的提取率的影响如图3所示,随着超声功率的升高,黄酮的提取率从先上升后趋于平稳最后下降,在超声功率为160 W时黄酮提取率达到最大值4.88%。这可能是因为超声功率的增大可以加速分子间震动,增大物质与溶剂的接触面积,加快了分子扩散速率,使得黄酮的提取率增加。当超声功率较高时,使得溶液温度也较高,破坏了黄酮分子的结构,导致黄酮稳定性下降,部分被氧化,使得黄酮的提取率降低[23-24]。

图3 超声功率对黄酮提取率的影响

2.1.4 超声提取温度对柚皮黄酮提取的影响 不同的超声提取温度对黄酮的提取率的影响如图4所示,随着超声温度的升高,黄酮的提取率先升高后趋近于平稳,在超声温度为30 ℃时黄酮提取率达到最大值为4.85%。出现这种情况可能因为超声温度升高可加快分子扩散速率,从而促进黄酮类物质析出,然而超声温度过高也会破坏部分黄酮结构并增加其它非黄酮物质析出,影响黄酮提取率,使得黄酮提取率下降[22]。

图4 超声温度对黄酮提取率的影响

2.1.5 超声处理时间对柚皮黄酮提取的影响 不同的超声提取时间对黄酮的提取率的影响如图5所示,随着超声时间的增加,黄酮的提取率先增大后下降,当超声时间到达50 min时,黄酮提取率达到最高4.88%,随着时间的延长,黄酮提取率缓慢下降。这可能是因为超声波能产生强烈空化效应和搅拌作用,随着超声时间延长,增加溶剂穿透力,加速溶质析出,总黄酮逐渐溶于乙醇提取液,得率逐渐增大。而超声时间超过50 min,一方面溶剂逸出,黄酮类化合物已经完全溶出,另一方面总黄酮结构可能受到破坏,导致提取率下降[21-22,25-26]。

图5 提取时间对黄酮提取率的影响

注:*表示影响显著(P<0.05);**表示影响极显著(P<0.01)。

2.2 响应面分析法优化试验

根据单因素试验结果,在最佳液料比为30∶1 mL/g,超声提取时间为50 min下,采用Box-Behnken设计对乙醇浓度(A)、超声功率(B)和超声温度(C)进行响应面优化,结果见表2,多元回归拟合得到提取得率(Y)与乙醇浓度(A)、超声功率(B)和超声温度(C)的回归方程为:y=-14.162+0.297A+0.097B+0.060C-1.462×0-4AB+2.925×10-4AC+1.316×10-4BC-2.098×10-3A2-2.797×10-4B2-1.433×10-3C2。

表2 响应面试验设计与结果

图7 乙醇浓度、超声温度对黄酮提取率的响应面图和等高线图

表3 二次回归模型方差分析

图6 乙醇浓度、超声功率对黄酮提取率的响应面图和等高线图

图8 超声功率、超声温度对黄酮提取率的响应面图和等高线图

2.3 提取工艺条件的优化和验证

通过Design-Expert 8.06 软件对二次多项式回归方程进行分析检测得出的最优条件是乙醇浓度67.47%、超声频率是163.83 W、超声温度35.19 ℃,在该条件下黄酮的提取率最高4.84%。根据实际情况考虑,将最佳的工艺调整为乙醇浓度为67%,超声频率为163 W,超声温度为35 ℃,在此条件下重复三次试验测得的黄酮提取率为4.90%,试验结果与理论结果非常接近,说明响应面法所得的优化提取工艺参数可靠有效。公衍玲等[15]采用星点设计-响应面优化乙醇提取柚皮中的总黄酮工艺,总黄酮得率为1.032%。黄建蓉等[27]采用响应面法对超声辅助提取柚皮中总黄酮的工艺进行优化,总黄酮提取率为5.301%。与相关文献对比,本实验采用响应面法优化琯溪蜜柚柚皮黄酮提取高于大部分文献报道的提取率,而与黄建蓉优化得到的提取量相当。可能因为是不同的柚子品种不同,所含有的黄酮含量不同,因此优化出的响应面结果会有所差异。该结果为琯溪蜜柚果皮黄酮的提取利用提供了工艺参考。

3 结论

本实验运用了超声波辅助乙醇法提取琯溪蜜柚柚皮中的黄酮,通过实验发现琯溪蜜柚柚皮黄酮的最佳提取工艺为液料比30∶1 mL/g、乙醇浓度67%、超声频率是163 W、超声温度35 ℃和超声提取时间为50 min。在此条件下,进行了三次平行试验后实测琯溪蜜柚柚皮黄酮提取率为4.90%。该方法运用于琯溪蜜柚柚皮黄酮的提取中工艺简单,效果好,可为进一步的实验研究奠定基础。