适于南瓜汁原料益生酵母菌的分离鉴定及发酵工艺优化

杜静婷,施俊凤,贾慧文,雷亚堃

(山西农业大学食品科学与工程学院,山西太原 030006)

益生菌是对人和动物健康有益的一类活菌的总称,不仅能赋予食物特殊风味和口感[1],还能调节肠道微生态环境[2],对健康大有裨益。常见的用于饮品的益生菌有双歧杆菌(Bifidobacterium)和乳杆菌(Lactobacillus)[3-4]。但越来越多的研究发现,酵母菌与乳酸菌具有共生互补作用[5],可作为益生菌在肠道中发挥有益作用,可将其应用于果蔬汁发酵中[6-8]。

南瓜(CucurbitamoschataDuch.)是一种高经济价值作物,营养丰富,富含多糖、β-胡萝卜素、生育酚等多种天然活性物质[9-11],具有降脂保肝[12]、防癌[13]、降血糖[14]、增强免疫等功效[10]。虽然南瓜有丰富的营养价值,但目前仍以鲜食为主,人们对其的摄入量有限。将南瓜加工制成发酵型饮料,既可以改善风味,满足人们对南瓜摄入量的需求,又可以达到营养保健的效果。目前关于南瓜发酵的研究较少,且大多采用现有菌种对南瓜进行发酵,并以其理化指标为响应值进行工艺优化[15-16],不能很好地反映饮料成品的口感。本研究以南瓜为原料,从山西传统发酵酱菜白萝卜中筛选适合于南瓜发酵的益生菌株,对其进行分子生物学鉴定及胃肠道耐受性实验,采用单因素实验和响应面试验结合的方法,以固酸比及感官评价作为指标,对南瓜发酵饮品的发酵工艺进行了优化,以期为新型饮品的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南瓜品种为“蜜本” 山西省河津市;传统酱菜 山西省代县农家;2×Power Taq PCR Mastermix,gold view Ⅰ型核酸染色剂 Solarbio公司。

Purifier Logic+型生物安全柜 美国Labconco公司;TC-96/G/H/B/C型Lifeeco基因扩增仪 杭州博日科技有限公司;Geldol-Lt 315型凝胶成像系统 美国UVP公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵菌株的筛选和鉴定 将传统方法发酵的酱菜白萝卜切丁后打浆,加少量蒸馏水稀释至不同浓度梯度后涂板,30 ℃培养48 h,划线法进行单菌落分离纯化,将纯化后的菌株对南瓜进行发酵,筛选口感风味好的菌株进行鉴定和发酵工艺优化。

根据真菌DNA基因组提取试剂盒的方法提取酵母菌DNA,采用ITS1(5′-TCCGTA GGTGAA aCCTGCG G-3′)和ITS4(5′-TCCTCC GCTTAT TGATAT GC-3′)引物对进行PCR扩增,反应体系为50 μL:2×MasterMix 25 μL,ITS1/4各2 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O 19 μL。PCR反应程序:94 ℃预变性4 min,94 ℃变性40 s,58 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,35个循环,72 ℃终延伸10 min。扩增完成后,取5 μL扩增产物电泳检测,用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Gel Extraction mini Kit W5221)回收纯化目的片段,纯化产物送Invitrogen公司测序。将测序结果与GenBank序列进行同源性比较,以登录号NR 111405为外参,以邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统发育树,重复1000次,计算进化树中每个分支的Boostrap值,确定酵母菌种类[17]。

1.2.2 体外胃肠道模拟耐受性实验 按云月英等[18]的方法配制人工胃肠液,28 ℃、160 r/min培养目标菌液24 h后,制成母液。接种1 mL母液至9 mL人工胃液中,于28 ℃、160 r/min条件培养2 h,随后取1 mL于人工肠液中发酵,分别于0、2、4、6、8 h进行菌落计数,测试菌株存活率,公式如下:

式(1)

式中:N1表示于各时间测得的菌落数;N0表示起始菌落数。

1.2.3 发酵南瓜汁工艺流程及操作要点 南瓜发酵的工艺流程如下:挑选南瓜→去皮、切块→预煮→打浆→稀释加糖→贴标签→装瓶→灭菌→冷却→接种→恒温发酵→指标测定。

操作要点:

a. 选料。选用完全成熟、色泽金黄、无机械伤及霉变、品质较好的南瓜。

b. 去皮、切块。清洗去瓤后去皮,将南瓜切成5 cm×5 cm块状。

c. 预煮。将切块后的南瓜于沸水浴中煮10 min。

d. 打浆。将预煮后的南瓜捞出打浆,按1∶10加入蒸馏水后过60目筛,去除未打碎颗粒物。

e. 装瓶灭菌。将稀释加糖后的南瓜汁装入250 mL的丝口试剂瓶中,虚拧瓶盖按实验条件进行灭菌,灭菌结束后拧紧瓶盖。

f.接种。于生物安全柜中进行,将发酵种子液加入南瓜汁中,进行恒温发酵。

1.2.4 感官评价 发酵饮料的可溶性固形物和总酸含量的测定参考程晨的方法[19]。感观评价采用评分的方法,评分人员共15人,分别对其评分并取其平均值。感官评价标准如表1。

表1 南瓜发酵饮料感官评定标准

1.2.5 单因素实验 对可能影响南瓜汁发酵工艺的各因素进行单因素实验,各单因素的不同水平如表2。进行各单因素实验时,其它固定因素水平分别为:南瓜浓度30%,加糖量5%,105 ℃灭菌20 min,接菌量5%,发酵时间48 h,发酵温度32 ℃,其中菌株母液浓度为5×1010CFU/mL。各处理设3个重复,以固酸比(式2)和感官分值作为评价指标。

表2 单因素实验因素水平表

式(2)

式中:NSSC表示可溶性固形物,°Brix;NTA表示可滴定酸含量,g/100 mL。

1.2.6 响应面试验 根据单因素实验结果选择接菌量、发酵时间、南瓜浓度、加糖量4因素设计Box-Behnken(BBD)实验。以感官评分作为响应值,实验设计见表3。

表3 BBD实验因素水平表

1.3 数据处理

采用NCBI BLASTn比对测序结果,MAGA-X构建系统发育树,SPSS 17.0对单因素实验数据进行差异显著性分析,Design expert 10.0.4.0进行Box-Behnken实验设计及分析。

2 结果与分析

2.1 发酵菌种的筛选

从传统酱菜发酵萝卜中共分离细菌115株,酵母菌86株,将各菌株经过初步发酵实验,以感官评价为响应值进行筛选,感官评价结果如表4所示。发现经不同菌株发酵后,南瓜汁的品质性状差异较大,其中菌株JC-1发酵后南瓜汁色泽鲜亮、香气浓郁、风味独特,其口感和色泽最优,因此选择该菌株为发酵菌株。

表4 发酵产香实验感官评定结果

2.2 发酵菌种的鉴定

以提取的纯化菌株基因组DNA为模板,应用通用引物ITS1/4进行PCR扩增,获得长度为500～750 bp的DNA片段(图1)。将其进一步测序,发现其碱基长度为611 bp,与GenBank序列比对发现与登录号MK394104.1的菌株同源性为100%。

图1 菌株JC-1的PCR产物电泳图

采用MEGA-X软件,以登录号NR 111405菌株为外参构建JC-1菌株的系统发育树。可以看出,JC-1与登录号为MK394104、LC413220、NR12006、MH782058、KY103245的5株D.hansenii菌株聚在一支,自展支持率为87%,表明JC-1菌株与D.hansenii亲缘关系最近。确定JC-1菌株为汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)。

图2 基于ITS基因序列构建的系统发育树

2.3 人工胃肠液耐受实验

在进食后1 h,胃酸pH大约为3.0,肠液中胆盐浓度最高约为1.8%[20],在此条件下模拟菌株在胃肠道中的生存能力,结果如图3。可看出经过共10 h的人工胃液和人工肠液培养后,菌株存活率可达78.48%(图3),与同类益生菌发酵饮料产品相比,存活率高20%左右[18,21-22]。

图3 人工胃肠液环境下JC-1菌株存活率

2.4 各因素对发酵南瓜饮品指标的影响

固酸比能反映发酵后南瓜汁的口感。实验中发现,当固酸比在7～13时菌株发酵后酸甜适口,口感较好。故以感官评分为主要依据,结合固酸比,对发酵南瓜汁的品质作出评价。结果表明,不同因素对发酵南瓜汁品质的影响也不同(图4),其中接菌量、发酵时间、南瓜浓度、加糖量4因素对南瓜汁感官评价值和固酸比的差异较大,而灭菌温度和发酵温度影响相对较小。可得出单因素实验中各因素最优值分别为接菌量12.5%、发酵时间60 h、南瓜浓度40%、加糖量7.5%、发酵温度32 ℃、灭菌温度110 ℃。故固定发酵温度32和110 ℃灭菌条件,设计4因素3水平响应面实验,进一步优化发酵工艺。

图4 各因素对南瓜饮品品质的影响

2.5 发酵南瓜汁工艺响应面优化结果

2.5.1 回归模型的建立 以感官评分为因变量,设计响应面优化试验。由于灭菌温度和发酵温度对感官评分影响较小,所以固定发酵温度为32 ℃,灭菌条件为110 ℃ 20 min,以接菌量、发酵时间、南瓜浓度和加糖量为自变量,设计4因素3水平的BBD实验。实验设计及结果如表5。

表5 BBD实验设计及结果

利用Design Expert 10.0.4.0对数据进行回归拟合,所得多元二次方程为:Y=90.08+7.51A+0.55B-1.54C+1.09D-4.56AB-0.44AC-0.95AD+2.22BC+1.03BD-2.15CD-8.03A2-7.27B2-10.38C2-7.36D2。

2.5.2 回归模型方差分析 对表4的响应面实验结果进行方差分析,如表6所示。

表6 回归模型方差分析表

同时可看出,A因素影响极显著(P<0.01),C因素影响显著(P<0.05),与单因素实验相一致;B、D两因素影响不显著(P>0.05),与单因素实验存在一定差异,可能是因为在四个因素的综合作用下,对汉逊德巴利酵母的发酵能力有所影响,从而导致南瓜汁品质发生一定变化。本实验四因素对发酵南瓜汁的影响大小排序为接菌量>南瓜浓度>加糖量>发酵时间;两因素交互作用中,AB交互作用影响极显著(P<0.01)。

2.5.3 响应曲面分析 根据表5中的实验结果,绘制响应面曲面图(图5),分析交互作用对发酵南瓜汁的感官评价的影响。由图5可知,当接菌量位于13.5%～17.5%,发酵时间在54～66 h时,南瓜汁的评分最高。接菌量在7.5%～13.5%,南瓜汁品质急速上升,说明添加一定量的菌种对南瓜品质的保证是必要的;随后趋势趋于平缓,说明菌种添加过多对品质的提升无显著影响。随着发酵时间的延长,南瓜汁品质先上升达到最高点后下降,说明在一定时间阶段发酵南瓜汁的品质最优,但时间过长或过短均不利于品质的提升。

图5 各因素交互作用的响应面图

2.5.4 验证实验 在BBD实验设计合理的前提下,优化实验最佳条件为接菌量15.0277%,加糖量7.73653%,发酵时间58.391 h,南瓜浓度38.9553%,在此条件下,感官评分为92.0093。考虑实验可行性,修正上述最优条件为:接菌量为15.0%,加糖量为7.7%,发酵时间为58 h,南瓜浓度为39.0%。在此条件下重复实验三次,进行感官评价,得分为91.68±2.35,与预测值92.0093相差0.37%,说明该方法所得结论可信。

3 讨论与结论

本实验所用菌株由山西传统发酵酱菜白萝卜中筛选,经18S rDNA鉴定,确定为汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)。有研究表明,该酵母对其他致病菌有毒害作用[23],能促进干酪、香肠及传统酱菜风味的形成[24-26],是一种有益微生物。将该菌株应用于食品发酵工业,可扩展酵母菌产业的多功能发展,促进酵母菌的研究与发展。

衡量益生菌能否发挥功能作用的一个重要指标是抵抗胃酸、胆盐的能力。不同菌株其耐受力不同,有学者分析了菌株在低pH和/或高胆盐浓度条件下菌株的存活情况。云月英等[18]对4株乳酸菌进行体外耐酸、耐胆盐测定,其中有2个菌株存活率达到50%以上。相比普通乳酸菌(lacticacidbacteria,LAB),汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)具有高耐盐特性[27],能更好地适应胃肠道微环境。实验室研究也证明这一点,与前人研究结论相同[28]。

经响应面进行发酵工艺的优化,发现在接菌量为15.0%,加糖量为7.7%,发酵时间为58 h,南瓜浓度为39.0%,发酵温度32 ℃,110 ℃灭菌20 min条件下,南瓜汁得分为91.68,口感最佳、组织结构及状态最好。以果蔬为基质生产发酵饮品是目前发酵行业中一个新兴产业。单一菌株与复合菌种发酵饮料相比,口感略单薄,将不同菌种按一定比例混合后发酵果蔬汁,可形成口感更丰富的功能性饮料。研究表明酵母菌与乳酸菌之间有共生作用,段小果等[5]研究表明不同菌种有互补机制,且代谢产物能相互促进或抑制,也有学者开始尝试将不同配比的菌种应用于发酵果蔬汁[6,29]。同时还可配比形成复合果蔬,经发酵形成一种口感清爽、有果蔬清香的功能饮料[30]。Xu等[31]将不同益生菌加入混合果蔬汁中发酵后产生了多种芳香类物质,并发现部分益生菌有富集硒的功能。复合菌种及复合果蔬发酵从而形成口感和谐、营养全面的新型发酵饮料是以后果蔬饮料发展的必然趋势。