时间分辨荧光免疫层析定量检测牦牛肉中喹诺酮类药物

赵维章,崔乃元,张汉青,贺敏华,张正英,王云平,马立才,*

(1.青海省动物疫病预防控制中心,青海西宁 810001;2.北京维德维康生物技术有限公司,北京 100095;3.广西壮族自治区兽药监察所,广西南宁 530001)

牦牛是青藏高原特有的家畜品种之一。大多分布于高寒草原牧区,不仅是高寒草原藏民族及其他少数民族聚居区经济发展的基础和象征,而且已成为青藏高原地区畜牧业发展的独立板块[1]。随着牦牛养殖规模的扩大,且由于养殖户基本以牧民为主,知识水平较低、生态养殖观念较差,为控制牦牛疫病的发生,在养殖过程中就存在着乱用、滥用、长期或超量使用兽药的现象,严重影响了牦牛肉的安全性[2]。

喹诺酮类(Quinolones)药物是人工合成的广谱性抗菌类抗生素,该类药物具有高效、低毒、广谱的特点,因而被广泛应用于畜牧、水产等养殖业的疾病防治[3-4]。喹诺酮类药物的长期使用会导致药物残留和细菌耐药性的产生,从而严重危害人类的健康,同时也具有致癌风险。因此,欧盟、美国、日本等国家已将喹诺酮类药物列为动物源性食品中残留检测的重点监控项目;美国FDA在2005年宣布禁止用于治疗家禽细菌感染的恩诺沙星的销售和使用;2015年我国农业部发布了2292号公告,在食品动物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种兽药[5]。目前喹诺酮类药物残留的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[6-9]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[10-11]、胶体金免疫层析法和酶联免疫分析法(ELISA)[12-16]、发光免疫分析法[17-18]等。色谱方法一般需要昂贵的仪器,检测成本高,且操作复杂,不适合在基层检测工作中使用。胶体金免疫层析法可以用于基层检测但不能定量,而酶联免疫法的检测时间相对较长,且酶在常温不稳定。

时间分辨荧光免疫分析技术(Time-resolved fluorescence immunochromatography assay,TRFIA)是近几年来发展起来的一种非同位素免疫分析技术,该技术操作简便、易自动化,可有效地排除非特异荧光的干扰,在分析灵敏度上有了很大的提高[19]。该技术兼具了胶体金操作简便和ELISA可定量的优点,广泛应用于药物残留的检测。时间分辨荧光分析技术在人类临床诊断[20-21]、兽药残留和食品安全检测[22]等方面都得到了广泛的应用,但是还没有牛、羊组织检测中应用的相关报道。因此,本研究利用铕微球作为抗体标记物建立一种简单、快速、高灵敏的牦牛肉中喹诺类药物(环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、达氟沙星)残留的荧光定量免疫层析检测方法,并对其灵敏度、准确性和精密度等指标进行评价,以期提供一种牦牛肉中喹诺酮残留量的快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

60份牦牛大腿肉 从青海省同仁县朝阳清真牛羊定点屠宰场购买,这些样品分别采集自青海牧区饲养的60头3岁左右的牦牛;甲醇、乙腈、磷酸氢二钾、盐酸、氢氧化钠、吐温20、乙酸乙酯、正己烷 国药集团化学试剂有限公司;牛血清蛋白(BSA) 美国Amresco公司;200 nm羧基化铕微球(365/610 nm,λex/λem) 美国Creative Diagnostics公司;硝酸纤维素膜(NC膜) 美国Millipore公司;样品垫、吸收垫、PVC底板 上海良信科技有限公司;环丙沙星单克隆抗体G10785、羊抗鼠二抗 北京维德维康生物技术有限公司制备;喹诺酮药物标准品 美国Sigma公司。

天子天平 天津德安特传感技术有限公司;冷冻离心机 美国Thermo Fisher Scientific;KQ-100E超声波清洗仪昆山市超声仪器有限公司;液相色谱-串联质朴仪 美国 Thermo Fisher Scientific公司;JYL-C090样品粉碎机 九阳;WH-400检测卡恒温孵育器、FQ-S2时间分辨荧光免疫定量分析仪(365/610 nm) 维德维康生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制 储备液配制:分别准确称取1.0 mg环丙沙星(纯度94.0%)、恩诺沙星(纯度95.0%)、诺氟沙星(纯度97.2%)、氧氟沙星(纯度99.3%)、达氟沙星(纯度94.3%)标准品,用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成100 mg/L的标准品储备液,于-20 ℃保存,备用。

复溶液配制:0.1 mol/L的Tris-HCl、0.5% BSA、0.5% Tween 20、5%蔗糖、0.9% NaCl、0.02% Proclin 300,调节pH为8.0。

1.2.2 荧光微球标记环丙沙星单克隆抗体的制备 本研究采用200 nm羧基化时间分辨荧光微球,具体操作步骤如下[23]:在50 μL荧光微球中加入450 μL活化缓冲液(0.05 mol/L MES,pH5.0),超声5 min;然后,向微球溶液中依次加入EDC和NHS溶液使其终浓度均为1 mmol/L,室温振荡反应30 min,15000×g离心10 min,弃去上清液;将沉淀用500 μL偶联缓冲液(0.04 mol/L PB,pH8.0)复溶,超声5 min,加入20 μL 2 mg/mL环丙沙星单克隆抗体,室温水平摇床2 h,15000×g离心5 min;向沉淀中加入500 μL封闭缓冲液(0.01 mol/L PB,2% BSA,pH8.0),4 ℃振荡反应过夜;将反应液用离心机以15000×g离心5 min,弃上清,再次使用50 μL复溶缓冲液复溶微球,超声仪超声3 min,4 ℃避光保存备用。

1.2.3 试纸条的制备

1.2.3.1 NC膜和样品吸收垫的制备 用划膜仪将环丙沙星抗原(1.8 μg/mL,1∶6稀释)和羊抗鼠二抗(17.5 μg/mL,1∶10稀释)包被于NC膜上作为检测线(T线,0.9 μL/cm)和质控线(C线,0.9 μL/cm),将制备好的NC膜置于37 ℃烘箱中过夜干燥。将羧基化铕微球标记的环丙沙星单抗喷于释放垫上,喷量为2.5 μL/cm,置于37 ℃烘箱中干燥2 h[24]。

1.2.3.2 试纸条的组装 参照图1所示,将样品垫、接合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘PVC底板上,上述结构的连接处重叠的长度约2 mm,以保证样品在试纸条上层析反应的顺利进行。最后,用斩切机切成3.95 mm宽度的试纸条,避光、干燥环境中保存。

图1 时间分辨荧光免疫快速检测试剂卡结构示意图Fig.1 Schematic diagram of fluorescent immunochromatographic strip

1.2.4 样品前处理 称取(3±0.05) g均质后的牦牛肌肉组织于50 mL 离心管中;加入5 mL乙酸乙酯,立即充分涡动5 min;然后用离心机(4000×g以上)离心5 min;取3 mL上清液于新的4 mL离心管中;50～60 ℃水浴中,氮气吹干;再加入2 mL正己烷,充分涡动30 s,最后加入1 mL 10 mmol/L PB(1%BSA,0.5% Tween 20,1%蔗糖),低速涡动30 s;4000×g以上,离心5 min;完全弃去上层正己烷及中间层杂质;取100 μL作为待测液[17];

1.2.5 检测步骤 取100 μL待测液滴加至喹诺酮类免疫荧光层析装置(图1)中的样本垫上,在40 ℃检测卡恒温孵育器中准确反应8 min后,取出并使用荧光免疫定量分析仪检测。

1.2.6 标准曲线的绘制及其交叉反应率试验 取喹诺酮类药物阴性的牦牛肉样品,向其中添加喹诺酮类药物标准溶液使其终浓度分别为:0.00、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00和8 μg/kg充分混匀后,按照1.2.4进行样本提取。然后,按照1.2.5进行检测。

选择与环丙沙星具有类似结构的药物恩诺沙星、达氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星进行测定,通过各种药物的标准曲线分别得到其IC50,根据公式:

式中:IC50(环丙沙星)为引起50%抑制环丙沙星的浓度,μg/kg;IC50(类似物)为引起50%抑制的环丙沙星类似物的浓度,μg/kg。

1.2.7 最低定量限(LOQ) 选取经 LC-MS/MS 检测[25]为喹诺酮类药物的阴性样本20份,采用时间分辨荧光免疫层析方法进行测定,分别得到20次结果的均值以及标准差,该方法的LOQ值即为20份牦牛阴性样本测定结果的均值加上10倍标准偏差。

1.2.8 准确度和精密度 向均质后牦牛肉空白样品中添加梯度浓度的喹诺酮溶液,使其终浓度分别为1、2和4 μg/kg,将每个浓度梯度添加3个平行;然后按照1.2.4和1.2.5分别进行前处理和检测。最后,对其准确度和精密度进行分析。

1.2.9 方法学比较 取50份牦牛肉样品,分别采用本文所建立的时间分辨荧光免疫层析定量分析法和GB/T 21312-2007《动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法》液相色谱-质谱/质谱法[25]进行检测,并对两种方法检测结果的一致性进行分析。

1.3 数据处理

以添加样本中喹诺酮类药物标准品浓度为X轴(每个浓度重复检测5次,取平均值),检测线T荧光信号值与质控线C荧光信号值的比值(T/C)为Y轴,用origin 8.0(Origin Lab Corp,Northampton,MA,USA)软件中的四参数拟合竞争标准曲线。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制及相关参数

根据所建立的环丙沙星时间分辨荧光免疫层析定量检测牦牛样本的标准曲线如图2所示,检测结果见图3，喹诺酮类药物的相关参数及交叉反应率见表1。

表1 喹诺酮类药物荧光免疫层析相关参数Table 1 Related parameters of fluorescence immunochromatography for quinolones

图2 TRFIA检测环丙沙星的标准曲线Fig.2 TRFIA standard curve for the detection of ciprofloxacin

图3 不同添加浓度对应的实物图Fig.3 Physical map corresponding to different added concentrations注:从左到右的检测卡对应牦牛肉样品中环丙沙星的添加浓度分别为0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00和8.00 μg/kg。

由表1可知,标准曲线回归方程的决定系数R2>0.99,说明线性方程好,其IC50较小,说明试剂盒灵敏度较好。环丙沙星抗体与恩诺沙星、达氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星的交叉反应率分别为77.36%、107.66%、93.55%和50.92%,说明该抗体能够用于检测恩诺沙星、达氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星几种喹诺酮药物。

2.2 定量限

利用所建立的喹诺酮时间分辨荧光免疫层析方法检测牦牛真实样本测试数据如表2所示,每个批次根据20个样本的所测平均值和标准差计算得到该方法对牦牛样本中喹诺酮类药物的定量限分别为:0.500(环丙沙星)、0.420(达氟沙星)、0.520(诺氟沙星)、0.620(恩诺沙星)和0.960 μg/kg(氧氟沙星)。

表2 时间分辨荧光免疫层析法定量限(μg/kg)Table 2 Limit of quantitation for time-resolved fluorescence immunochromatography(μg/kg)

2.3 与仪器方法对比

本文以环丙沙星为例,应用本研究所建立的TRFIA方法来检测牦牛肉中环丙沙星药物(添加浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0 μg/kg),并且同LC-MS/MS方法进行确认比较,其试验结果如图4所示。上述两种方法检测结果的线性方程为:Y=0.955x+0.039,决定系数R2=0.978。由此可知,两种方法对环丙沙星药物检测结果一致性较高。

图4 喹诺酮类药物时间分辨荧光免疫层析与HPLC-MS/MS结果对比Fig.4 Comparison of TRFIA with HPLC-MS/MS results for quinolones

3 讨论

喹诺酮类药物是继磺胺药之后迅速发展起来的一类十分重要的人工合成抗菌药物,被广泛用于动物的多种感染性疾病的预防和治疗。随着喹诺酮类药物的广泛使用,其不良反应的报道也日益增多。主要表现为动物食欲减退、腹泻[26]、甚至还会造成肝损害、引发周围神经病变时间加快等[27]。为了更加高效的对牦牛肉中喹诺酮类药物进行检测,本文建立了时间分辨荧光免疫层析方法。

赵莉莉[28]采用时间分辨荧光免疫层析法,建立了恩诺沙星的检测方法。该方法采用稀土离子Eu3+标记技术建立恩诺沙星时间分辨免疫检测法并对其进行方法学的考核,检测其灵敏度为5 ng/L。谢世红等[29]建立了用于快速检测喹诺酮类药物残留含量的胶体金免疫层析检测方法,检测出水产品中,环丙沙星的检测限为2 μg/kg,可同时检测15种喹诺酮类药物。孙晓峥等[30]利用胶体金免疫层析技术检测肉鸡组织中氟喹诺酮的残留量。结果表明,达氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星等药物的检测限为3.2 ng/mL。本研究建立的时间分辨荧光免疫层析方法的定量限为0.42～1.10 μg/kg,显著低于其他荧光免疫层析方法的定量限。

郑百芹等[31]利用酶联免疫技术研制了一种快速检测鱼肉中的喹诺酮类药物试剂盒,经过试验测试,该试剂盒对鱼肉样本中氧氟沙星、环丙沙星、氨氟沙星等3种喹诺酮类药物的检测限为1.0 μg/kg。李新朋等[32]采用间接竞争酶联免疫检测方法检测氟喹诺酮类药物在鸡肉中的残留量,其试验结果检测出10种氟喹诺酮类药物的检测限为0.09～0.64 ng/mL,回收率为85.1%～95.7%。周月华等[33]应用酶联免疫试验法,检测出41份肉鸡样品中喹诺酮类药物的残留量在14.5～60 ng/mL。与ELISA方法相比,时间分辨荧光免疫层析方法的操作更简单,检测时间只需要8～10 min,可以减少试验误差,结果更为准确。

龙启萍等[2]使用超高效液相色谱-串联质谱方法检测牦牛肉中11种喹诺酮药物的残留量,结果表明该方法测定牦牛肉的定量下限为1.5 μg/kg,平均回收率为84.2%～97.7%。上述仪器方法与本研究建立的时间分辨荧光免疫层析的灵敏度基本一致,但仪器方法的检测成本高,检测时间长且操作困难,不适合大批量的样品检测,而时间分辨荧光免疫层析方法操作简单易学,检测成本低。

4 结论

本研究建立了时间分辨荧光免疫层析方法,通过对牦牛肉样品中添加喹诺酮药物分析其最低检测限、准确度和精密度等指标。本方法对牦牛肉中喹诺酮药物的定量限低于0.96 μg/kg,批内添加回收率为82.94%～111.27%,变异系数为4.13%～9.90%,批间回收率为88.86%～107.05%,变异系数为3.86%～9.39%。与环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、达氟沙星的交叉反应率分别为100%、77.36%、107.66%、93.55%和50.92%。由此说明,本研究建立的牦牛肉中喹诺酮药物残留检测方法的准确度、精密度、灵敏度均较高,操作简便,可用于牦牛肉中喹诺酮类药物的实际检测。