香蕉果酒低温发酵过程中挥发性香气成分的变化

韦 璐,杨昌鹏,孙钦菊,黄 杰,陈智理,唐 婷

(广西农业职业技术学院,广西南宁 530007)

香蕉是全世界最重要的热带水果之一,产量居世界前四[1]。香蕉果肉营养价值颇高,含有丰富的碳水化合物、蛋白质、氨基酸、维生素和多种微量元素,它具有降血压、抗肥胖、防忧郁,缓解胃溃疡和肌肉痉挛、美白淡斑等多种功效[2-3]。但是香蕉是一种典型的呼吸跃变型果实,采摘后快速成熟,同时由于产地集中,采收季节相近,使得生产地香蕉滞销严重,异地销售在运输过程中同样易造成大量损耗[4-5],因此需要加快香蕉深加工工业化道路,提高香蕉的附加值,从而促进中国香蕉产业的发展[6]。

香蕉果酒由香蕉果汁经发酵获得,是一种含酒精的饮料[7]。香蕉果酒入口绵软,芳香清甜,富含钾、镁等矿质营养,还含有多种氨基酸与酚类物质,长期饮用适量香蕉果酒有益于身体健康,对保护心脏、预防高血压与心脑血管疾病有一定功效[5]。香蕉果酒符合当前酒类消费所提倡的以低酒精度替代高酒精度、以果酒替代粮食酒的趋势[8]。

温度是影响微生物发酵的重要因素[9]。首先,温度影响微生物的生长繁殖,适宜的低温发酵可以有效抑制杂菌的生长,防止酒品酸败;其次,温度通过影响微生物的酶促反应,从而影响其代谢产物的合成,低温发酵过程缓慢、周期长,代谢过程反应完全,有利于风味物质的形成,张惠玲[9]研究发现,酵母菌在低温(10 ℃)时发酵平稳、周期长,酒体香味物质丰富,还可以防止杂菌的侵害;另外,低温发酵还可以有效提高酒体的营养及活性成分,使其口感柔和、果味浓郁[8]。

易挥发香气成分是影响果酒风味品质的重要因素,可作为果酒品质的评价指标[10-11]。当前针对香蕉产品,多数研究集中在香蕉果酒工艺研究方面,针对香蕉果酒易挥发成分及其在发酵过程中的变化规律方面仅有少数学者研究,如温海祥等[12]研究分析发现,香蕉酒中含有38种香气物质,主要成分为酯类和醇类。郭先霞等[13]分析三华李香蕉复合果酒的香气成分,研究发现复合果酒中含有13种香气成分,主要香气组成成分为3-甲基-1-丁醇(29.30%)、己酸乙酯(16.61%)、丁酸-3-甲基丁酯(15.08%)和辛酸乙酯(14.66%)等,而针对在低温条件下发酵生产香蕉果酒的研究尚未见报道。

因此,本文研究在低温条件下酿制香蕉果酒,并采用顶空固相微萃取法[14](head space solid-phase microextractions,HS-SPME)结合气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技术[15-16]对香蕉果酒发酵前期(1 d)、中期(4 d)及末期(9 d)样品中的易挥发性成分进行提取分析鉴定,研究香蕉果酒发酵过程中主要香气成分的变化规律,旨在为香蕉果酒的品质形成提供参考,也为后期低温发酵生产香蕉果酒的研发及产业发展提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香蕉 西乡塘市场;高活性干酵母 南宁市安琪酵母有限公司;焦亚硫酸钾 烟台帝伯仕自酿机有限公司;果胶酶、白砂糖 南宁东恒华道生物科技有限责任公司 食品级;氢氧化钠 西陇科学股份有限公司 优级纯。

高效液相色谱仪(LC20A) 日本岛津公司;TRACE DSQ 气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)联用仪、DB-WAX毛细管柱(30 m× 0.25 mm,0.25 μm) 美国Finnigan公司;固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)装置手柄、固定搭载装置、50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取头 美国Supelco公司;MS204S电子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司;循环水式多用真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司;WZS32手持阿贝折光仪 上海仪电物理光学仪器有限公司;3H16RI智能高速离心机 湖南赫西仪器装备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 香蕉果酒制备工艺流程

1.2.2 操作要点 原材料的选取:八成熟的新鲜香蕉,无褐变,无腐烂。

去皮打浆:香蕉去皮切块,放入打浆机中打浆。

酶解:将香蕉浆放入烧杯中,添加0.03%～0.5%的果胶酶、0.03%～0.3%的葡萄糖淀粉酶、0.03%～0.5%的纤维素酶组成的混合酶,用保鲜膜封口,置于恒温为60 ℃的水浴锅中酶解2～5 h。

过滤:将酶解液经离心机离心,过滤得到香蕉汁。

接种:加入0.03%的酵母,酵母在加之前要先经过活化。

调配:香蕉汁中加入适量白砂糖使其质量分数达22%[17]。

低温发酵:将发酵液置于20 ℃培养箱,静置发酵。

1.2.3 果酒香气成分HS-SPEM-GC-MS分析 样品制备:取5 mL样品置于20 mL顶空瓶中,加入15 μL 50 μg/mL的2-辛醇作内标,将老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取头插入样品瓶顶空部分,于50 ℃吸附30 min,随后将吸附后的萃取头取出,插入气相色谱进样口,于250 ℃解吸3 min,同时启动仪器进行GC-MS分析采集数据。

GC条件:毛细管柱为DB-WAX(30 m×0.25 mm,0.25 μm),程序升温,起始温度40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min升至90 ℃,再以10 ℃/min升至230 ℃,保持7 min,进样口温度250 ℃。载气流量0.8 mL/min,为恒定流量模式[12]。

MS条件:电离方式为EI源;离子源温度200 ℃;接口温度250 ℃;电离能量70 eV;发射电流120 μA;检测器电压1.0 kV,质量扫描范围33～400 amu;标准谱库为NIST2.0[13]。

1.3 数据处理

实验所得数据采用Origin 9.1软件进行数据处理及绘图,采用Adobe Illustrator CS5软件进行数据图表的修饰。

2 结果与分析

2.1 香蕉果酒发酵过程中主要香气成分组成分析

采用HS-SPEM-GC-MS技术分析鉴定香蕉果酒低温发酵过程中前期(1 d)、中期(4 d)及末期(9 d)发酵样品的香气成分组成,实验结果表明(表1、表2),三个样品的主要香气成分均为酯类、醇类,占据挥发性成分的60%以上。发酵前期,香蕉果酒中检测到57种挥发性成分,其中酯类29种,占比42.731%;醇类9种,占比22.325%;酸类3种,占比0.654%;羰基类5种,占比3.434%;烷烃类9种,占比7.317%;酚类2种,占比0.608%。发酵中期,香蕉果酒的香气成分中除醇类物质占比略微下降之外,其他物质含量均呈上升趋势,此时果酒中检测到62种香气成分,其中酯类27种,占比48.712%;醇类8种,占比20.941%;酸类5种,占比3.342%;羰基类6种,占比4.685%;烷烃类13种,占比9.444%;酚类3种,占比0.703%。发酵到达终点时,香蕉果酒中醇类物质含量明显增加,羰基类和烷烃类含量呈下降趋势,而酸类和酚类物质变化则不明显,此时果酒共检测到51种香气成分,其中酯类27种,占比35.74%;醇类7种,占比31.576%;酸类6种,占比3.155%;羰基类3种,占比1.209%;烷烃类6种,占比5.388%;酚类2种,占比0.705%。

表1 香蕉果酒发酵过程中香气成分GC-MS的分析结果Table 1 Analysis results of aroma components in banana wine by GC-MS during the fermentation

续表

续表

表2 复合果酒发酵过程中第1、4、9 d中各香味成分种类数量Table 2 Numbers of aroma components on days 1,4 and 9 of compound fruit wine in fermentation process

图1 香蕉果酒发酵过程中各阶段样品香气成分的GC-MS总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of aroma components in various stages of Banana wine fermentation by GC-MSA:发酵前期(1 d);B:发酵中期(4 d);C:发酵末期(9 d)。

因此,在香蕉果酒低温发酵期间,香气成分总相对含量呈先上升后下降,之后趋于平稳的状态。其中醇类、酸类和酚类物质含量逐渐增加,而酯类、羰基类和烷烃类占比先增加后减少,总体呈下降趋势(图2)。

图2 香蕉果酒发酵过程中各阶段样品香气成分的相对含量Fig.2 Content of aroma components in various stages of Banana wine fermentation

2.2 香蕉果酒发酵过程中主要香气成分种类分析

2.2.1 发酵过程中酯类物质变化分析 酯类物质在果酒香气呈现中起重要作用,可作为评价果酒的重要指标[18],其来源可能有以下几条途径:一是直接来源于香蕉;二是通过酯化反应获得;三是酵母菌活动的产物。由于发酵末期酵母菌活动较弱,因此与发酵中期相比,末期香蕉果酒中酯类物质有所下降。其中乙酸乙酯、乙酸异丁酯、异戊酸丁酯、2-乙基己基乙酸酯、己酸异戊酯、醋酸辛酯、壬酸乙酯、月桂酸甲酯、1-甲基乙基-2-甲基丙酸酯、癸酸异戊酯仅存在于发酵前期,发酵中期和末期香蕉果酒中均未检测到,而在发酵末期香蕉果酒中检测到的乳酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、顺式-2-丁烯酸乙酯、4-己烯羧酸甲酯、异丁酸戊酯、顺式-4-辛烯酸乙酯、乙酸环己基乙酯、γ-丁内酯、4-羟基丁酸乙酯,在发酵前期和中期香蕉果酒中均未发现。

酯类大多具有花香和果香等特性,图3为香蕉果酒相对含量较高的几种酯类成分,选取其中研究较多且香气较为突出的成分进行详细分析:如辛酸乙酯(12.165%)含量最高,具有玫瑰花香和橙果香,赋予果酒白兰地香型香气[19];其次是癸酸乙酯(8.114%),赋予香蕉果酒似葡萄的果香及椰子香型香气,是葡萄酒香气的重要成分[20];己酸乙酯(3.168%),赋予香蕉果酒草莓香味、茴香味和青苹果香味[18];乙酸苯乙酯(2.597%)具有玫瑰花香、类似苹果样的果香和蜂蜜样的甜香;异戊酸丁酯呈香蕉香气和蓝干酪香味;辛酸甲酯(0.212%)呈水果、甜橙香气;另外,一些低含量的香气成分同样能辅助提升香蕉果酒的整体品质,如乙酸乙酯具有强烈的似梨果香及菠萝香味[21-22];丁酸异丁酯(0.042%)具有似苹果和菠萝样香气,还有朗姆酒样的甜味;丁酸异戊酯具有强烈的香蕉、洋梨芳香气味;月桂酸乙酯(0.024%)具有油脂、稍带叶样和似花瓣的温和香气;十四酸乙酯呈椰子和鸢尾油香气,并带有油脂气息[23]。

图3 香蕉果酒发酵过程中各阶段样品酯类物质的相对含量变化Fig.3 Relative content changes of esters substancesin various stages of Banana wine fermentation

酯类物质在香蕉果酒挥发性香气成分中占比最大,种类最多,对果酒的香气品质有重要作用,是影响香蕉果酒香型的主要因素[24]。李凯等[25]研究发现红心火龙果酒中共检测到118种香气成分,其中酯类物质含量最高,对酒体的香型贡献最大,其次是醇类及酸类,赋予果酒水果香及花香,还有少量醛类、烯烃类及酚类物质辅助果酒香气的形成,这与本文香蕉果酒的研究结果相一致。

2.2.2 发酵过程中醇类物质变化分析 图4为香蕉果酒相对含量较高的几种醇类成分在发酵过程中的变化情况,醇类是果酒的主要呈味物质,在果酒口感及香型的形成方面发挥重要作用。醇类物质来源可能有两条途径:一是糖分解代谢的产物,二是通过氨基酸Ehrlich途径转化获得,是果酒香气中的主要成分[26],相对含量仅次于酯类。醇类物质在香蕉果酒低温发酵过程中增加显著,本文选取几种常见成分进行详细分析,其中尤其乙醇(19.447%)相对含量增加最为明显,由前期的10.491%增加至末期的19.447%,是酒精发酵阶段的主产物,香气柔和、甜润,可以辅助果酒呈香;其次是异戊醇(9.656%),赋予果酒成熟的果香和草香味[27],在整个发酵过程中呈现先下降后上升的趋势,前期和末期的含量相差不大;发酵末期异丁醇的含量高于前期和中期;而正己醇和2-戊醇含量相对较小,发酵过程中变化不明显。此外,正戊醇、顺式-3-辛烯-1-醇和1-辛炔-3-醇仅在发酵前期检测到,2-十二烷醇和3,3-二甲基-2-戊醇则是在发酵后期形成的,这些醇类物质赋予果酒馥郁、醇厚的味道和口感。

图4 香蕉果酒发酵过程中各阶段样品醇类物质的相对含量变化Fig.4 Relative content changes of alcoholic substancesin various stages of Banana wine fermentation

2.2.3 发酵过程中酸类物质变化分析 图5为香蕉果酒相对含量较高的几种酸类成分在发酵过程中的变化情况,酸类物质是酵母的次级代谢产物,同时也作为酯类合成的前体物质[28-29]。香蕉果酒低温发酵过程中,酸类物质的种类及含量呈上升趋势,本文选取对果酒香气贡献较大的几种成分进行详细分析,其中辛酸(1.69%)相对含量最高,相对含量先增加后减少,但末期含量仍高于前期,具有奶酪味和水果香气;其次为乙酸(0.336%)总体呈上升趋势,具有浓郁的醋香味;正癸酸是在发酵中期时产生的,发酵末期有些许下降;正己酸(0.44%)和乙酰丙酸仅在发酵末期存在,正己酸具有类似于干奶酪的气味,这些酸类物质一般具有强烈的刺激性口感,对香蕉果酒的口感影响较大,低浓度时具有清新、使人愉快的香味,对果酒的口感及滋味有较好的修饰作用,若浓度过高则会对酒体的香味和品质造成负面影响[18,30]。

图5 香蕉果酒发酵过程中各阶段样品酸类物质的相对含量变化Fig.5 Relative content changes of acids substancesin various stages of Banana wine fermentation

2.2.4 发酵过程中羰基类物质变化分析 图6为香蕉果酒相对含量较高的几种羰基类成分在发酵过程中的变化情况,羰基类物质主要包括醛类和酮类,它们多数是由微生物代谢产生的[31]。香蕉果酒中羰基类物质含量虽然不高,但这些物质独有的香气特征对香蕉果酒的呈香有较好的辅助作用。本文选取目前研究较多的几种香气成分进行着重分析,其中2-戊酮和2-庚酮,在发酵过程中含量逐渐减少,后者具有似梨的水果香味;壬醛(0.081%),在发酵中期时产生,到发酵末期明显下降,具有玫瑰、柑橘等香气[32];除此之外,还有异戊醛具有令人愉快的水果香气[33];癸醛具有甜香、柑橘香、蜡香及花香;十二醛具有浓郁的脂肪香气,并有类似松叶油和橙油的香气;3-羟基-2-丁酮稀释后具有奶香味、香甜的焦糖气味及果甜味[18];2,3-戊二酮具有奶油、焦糖香气;十一醛具水果香和甜橙玫瑰样花香。这些羰基类物质与其他香气成分协同作用,共同形成香蕉果酒浓郁、饱满的香型。

图6 香蕉果酒发酵过程中各阶段样品羰基类物质的相对含量变化Fig.6 Relative content changes of carbonyls substancesin various stages of Banana wine fermentation

2.2.5 发酵过程中烷烃类和酚类物质变化分析 除了酯类、醇类、酸类及羰基类物质外,香蕉果酒中还有烷烃类及酚类物质存在,图7、图8分别为香蕉果酒相对含量较高的几种烷烃类、酚类成分在发酵过程中的变化情况,在整个果酒发酵阶段,其相对含量和种类均呈现先增加后减少的趋势,烷烃类物质含量仅次于酯类和醇类,选取当前学者研究较多的几种成分着重分析,其中S-(-)-柠檬烯在发酵中期含量最高,末期明显减少,它仅在香蕉果酒中存在,具有柠檬味;γ-松油烯含量呈上升趋势,但发酵末期含量降为0;2-丁烯总体也呈上升趋势,发酵中期含量为0;十一烷和苯乙烯含量较低,前者先增加后减少,后者仅在发酵前期检测到。另外,酚类物质在总的挥发性香气物质中占比最小,其中2,4-二叔丁基苯酚含量最多,发酵过程中含量逐渐增加;其次为丁香酚,总体呈下降趋势,具有浓郁的丁香香气和温和的辛香香气;而4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚仅在发酵中期存在,这些烷烃类和酚类物质虽然含量相对较少,但具有明显的香气特征,对香蕉果酒的主体香气有较好的修饰作用。

图7 香蕉果酒发酵过程中各阶段样品烷烃类物质的相对含量变化Fig.7 Relative content changes of alkanes substancesin various stages of Banana wine fermentation

图8 香蕉果酒发酵过程中各阶段样品酚类物质的相对含量变化Fig.8 Relative content changes of phenols substancesin various stages of Banana wine fermentation

除了酯类、醇类、酸类及羰基类物质外,香蕉果酒中还有烷烃类及酚类物质存在,图7、图8分别为香蕉果酒相对含量较高的几种烷烃类、酚类成分在发酵过程中的变化情况,在整个果酒发酵阶段,其相对含量和种类均呈现先增加后减少的趋势,烷烃类物质含量仅次于酯类和醇类,选取当前学者研究较多的几种成分着重分析,其中S-(-)-柠檬烯在发酵中期含量最高,末期明显减少,它仅在香蕉果酒中存在,具有柠檬味;γ-松油烯含量呈上升趋势,但发酵末期含量降为0;2-丁烯总体也呈上升趋势,发酵中期含量为0;十一烷和苯乙烯含量较低,前者先增加后减少,后者仅在发酵前期检测到。另外,酚类物质在总的挥发性香气物质中占比最小,其中2,4-二叔丁基苯酚含量最多,发酵过程中含量逐渐增加;其次为丁香酚,总体呈下降趋势,具有浓郁的丁香香气和温和的辛香香气;而4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚仅在发酵中期存在,这些烷烃类和酚类物质虽然含量相对较少,但具有明显的香气特征,对香蕉果酒的主体香气有较好的修饰作用。

3 结论

本文采用HS-SPEM-GC-MS技术对香蕉果酒低温发酵过程中前期、中期及末期香蕉果酒的香气成分进行分析,研究了香蕉果酒发酵过程中主要香气成分的变化规律。研究结果表明:在香蕉果酒低温发酵期间,香气成分总相对含量呈先上升后下降,之后趋于平稳的状态,其中醇类、酸类和酚类物质含量逐渐增加,而酯类、羰基类和烷烃类占比先增加后减少,总体呈下降趋势,同样香气成分的种类先增加后减少,由前期的57种到末期的51种。果酒发酵前期主要香气成分为:辛酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、山梨酸乙酯、己酸乙酯、辛酸甲酯、乙醇、异戊醇、2-戊酮及S-(-)柠檬烯;发酵中期为:辛酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、山梨酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、丁酸异戊酯、乙酸苯乙酯、乙酸己酯、乙醇、异戊醇、辛酸、2-戊酮、壬醛、癸醛、S-(-)柠檬烯及γ-松油烯;发酵后期为辛酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、己酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙醇、异戊醇、异丁醇、辛酸、2-戊酮、2-丁烯,这些挥发性成分共同形成了香蕉果酒的独特风味品质。该研究对香蕉果酒风味物质的构成及发酵过程中主要香气成分的变化规律有了初步了解,为香蕉果酒品质形成了提供参考,也为后期低温发酵生产香蕉果酒的工业化发展提供了理论依据。