PAK6、p53在膀胱癌中的表达及其临床意义

董 宇 马淑盟 刘 芬 路喜安

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，据研究显示，膀胱癌发病率与病死率呈逐渐上升的趋势，其复发率及远处转移率高，预计后期发展不容乐观[1-4]。膀胱癌在65岁以上的人群中有很高的发病率，但近年来发现，发病年龄逐渐降低，有低龄化趋势，而男性发病率比女性高，男女发病率比例为3∶1～4∶1[5]。所以，目前要解决的问题是寻找特异性靶向治疗目标。P21活化激酶(p21-activated kinases，PAKS)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，近年来有研究显示，作为小G蛋白Rho家族Cdc42和Racl的下游效应分子，在肿瘤细胞信号传导中发挥促进细胞信息传导、抑制细胞死亡、调节细胞骨架重排、细胞增生、血管生成等重要作用[6]。P21活化激酶6(p21-activated kinase 6，PAK6)是P21活化激酶的6个成员之一，也是首个发现与激素受体作用相关的成员。PAK6基因位于人染色体15q14区，编码的蛋白质为75 kD蛋白质。以往研究发现PAK6在肝癌与前列腺组织中有高表达，但目前很少有PAK6在膀胱癌组织中的研究。p53基因是细胞中期中重要的调节因子，一般认为是参与DNA的修复和复制过程，具调节血管生成、促进凋亡等作用。Biu-87、T24细胞均为膀胱癌细胞，来源于人膀胱癌；SV-HUC-1细胞为正常膀胱细胞。本实验中通过检测膀胱癌患者组织中PAK6、p53表达以及Biu-87、T24、SV-HUC-1细胞中PAK6、p53表达，探讨PAK6、p53在膀胱癌组织以及膀胱癌细胞中的表达状况以及临床意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取本院2016年2月至2018年2月诊治的膀胱癌患者85例，设为膀胱组，其中男性67例，女性18例；年龄44～86岁；原发膀胱癌53例，复发膀胱癌32例；取以上患者的膀胱癌组织进行研究。纳入标准：①所有入选患者手术后通过病理活检证实为膀胱癌；②在手术前均没有任何放疗、化疗、激素治疗、免疫治疗等；③所有进入此研究的患者均签署过知情同意书。排除标准：合并心、肝、肾等主要器官病变的患者。取35例同时期行膀胱部分切除或者全部切除的患者，设为对照组，男性23例，女性12例；年龄54～70岁；再取其正常的膀胱上皮组织进行研究。2组患者的年龄、性别比例等一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。研究中所使用的Biu-87、T24膀胱癌细胞、SV-HUC-1正常膀胱细胞均购自中国科学院典型培养物宝藏委员会细胞库，分别为Biu-87组、T24组和SV-HUC-1组。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养Biu-87、T24膀胱癌细胞，用含有5%胎牛血清的DMEM培养基培养SV-HUC-1正常膀胱细胞，将含有细胞的培养基放入温度37 ℃且含有5%CO2的培养箱中进行孵育，2～3天后细胞培养完成可用于实验。

1.2.2 免疫组织化学法检测膀胱组与对照组组织PAK6蛋白阳性表达 膀胱组与对照组组织用10%甲醛固定，用乙醇脱水，再用石蜡包埋后制作成4 μm厚度的连续切片，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。将石蜡切片放入温度为60 ℃的温箱中干燥0.5～1 h，再用二甲苯进行脱蜡，梯度乙醇进行水化。之后用高压抗原修复法对抗原进行修复，内源性过氧化酶阻断剂浸泡10 min，PBS液冲洗3次，免疫血清封闭10 min，PBS液冲洗3次。后除去PBS加入稀释过的一抗，即浓度为1∶200的PAK6/P30，温度4 ℃下过夜，PBS冲洗3次；再滴加二抗，即被生物素标记过的羊抗鼠/兔IgG；在室温下孵育10 min，PBS液冲洗3次；再滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化氢酶，继续在室温下孵育10 min，PBS液冲洗3次；然后滴加新鲜配置的DAB溶液进行显色，用流水冲洗；用苏木精复染，再用盐酸乙醇分化，流水冲洗，用梯度乙醇进行脱水干燥，二苯甲透明，中性树胶封片。

判断标准：每张切片都随意选取5个高倍镜下视野(×400)，分别观察染色强度和阳性细胞数。首先按照染色情况进行计分：无着色计分为0，淡黄色计分为1，棕黄色计分为2，棕褐色计分为3。然后按照阳性细胞所占所有细胞数量的百分比进行计分：阴性计分为0，阳性细胞百分比为≤10%计分为1，百分比>10%～50%计分为2，>50%～75%计分为3，>75%则计分为4。计算染色强度所计分和阳性细胞百分率乘积，若得到的值>3分则记为免疫反应阳性。

1.2.3 实时荧光定量PCR法检测Biu-87组、T24组和SV-HUC-1组PAK6、p53 mRNA表达水平 取出用6板孔培养好的3组细胞，冲洗，在每个孔中加入500 μl Trizol试剂并按照步骤提取出细胞中的总RNA，并使用分光光度仪检测RNA浓度。再用反转录试剂盒将提取的RNA合成cRNA，根据合成的模板cRNA对PAK6及p53基因进行实时荧光定量PCR反应。引物序列可见表1。反应体系：SYBR Premix Ex TapⅡ10 μl，模板DNA 2 μl，正向引物0.8 μl，ROX Reference Dye or DyeⅡ0.4 μl，DEPC H2O 6 ml。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 10 s。共进行40个循环后72 ℃延伸5 min。反应完成后，取5 μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

表1 引物序列

1.3 统计学处理分析

2 结果

2.1 膀胱组与对照组组织PAK6、p53阳性表达率的比较

膀胱癌组组织的PAK6蛋白阳性表达率与对照组相比较低，差异有统计学意义(χ2=29.87，P<0.05)。膀胱癌组组织的p53蛋白阳性表达率与对照组相比较明显较高，差异具有统计学意义(χ2=10.75，P<0.05)。见表2。

表2 2组PAK6、p53阳性表达率比较(例，%)

2.2 膀胱癌组组织中PAK6、p53蛋白阳性表达率与临床病理指标间的关系

膀胱癌组PAK6蛋白阳性表达率在肿瘤的数量、病例分级、转移情况以及临床分期方面差异无统计学意义(P>0.05)。膀胱癌组复发者PAK6蛋白阳性表达率(28.13%)相对于原发者(56.60%)较低(P<0.05)。由数据可知，膀胱组单发者p53蛋白阳性表达率明显低于多发者，病理等级低者p53蛋白阳性表达率明显低于高级别，临床分期浅表性癌p53蛋白阳性表达率明显低于浸润性，膀胱癌组复发者p53蛋白阳性的表达率明显高于原发者，膀胱组转移者p53蛋白阳性表达率明显高于未转移者，差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表3 膀胱癌组PAK6、p53表达与临床病理指标之间的关系(例，%)

2.3 Biu-87组、T24组和SV-HUC-1组细胞PAK6、p53 mRNA表达水平的比较

Biu-87组、T24组和SV-HUC-1组3组细胞PAK6、p53 mRNA的表达水平比较差异具有统计学意义(F=20.559，P=0.002)。SV-HUC-1组PAK6 mRNA表达水平(0.44±0.13)高于Biu-87组以及T24组(0.20±0.1、0.12±0.11)(t=13.49，P<0.01；t=17.32，P<0.01)，而Biu-87组PAK6 mRNA表达水平明显比T24组高(t=4.96，P<0.01)。SV-HUC-1组p53 mRNA表达水平(0.36±0.12)低于Biu-87组(0.53±0.21)以及T24组(0.65±0.11)(t=6.48，P<0.01；t=16.42，P<0.01)且Biu-87组p53 mRNA表达水平明显比T24组低(t=4.67，P<0.01)。

3 讨论

膀胱癌是泌尿系常见的一种恶性肿瘤，其发病率与病死率均居恶性肿瘤的前列，且近些年来，膀胱癌的发病率与病死率逐渐升高，主要的发病年龄在中年后[7]。膀胱癌有易侵袭，复发率高，易耐药等多种特性[8]。PAKs是丝氨酸/苏氨酸家族之一，在生长因子信号中有十分重要的作用，可以引起细胞骨架重组，并对迁移和转移生长因子介导产生一定的影响[9-10]。虽然PAKs家族蛋白在癌症中并不会发生突变，但是他们在一些癌症中表达或者扩增过度使其变成对我们极具吸引力的治疗靶点[11]。但是目前在对PAKs的研究中，很少出现对PAK6相关方面的研究。PAK6能够促进部分肿瘤进展，具有致瘤性，在原发性及转移性的前列腺癌中有高表达，还在去势治疗后复发的患者中有着高表达[12-13]。在研究中发现，在前列腺癌中，PAK6可使雄激素受体的ser-578磷酸化，促进雄激素受体-泛素化蛋白连接酶结合，在雄激素刺激下使得雄激素受体被降解，抑制了雄激素受体和转移[14-16]。同时，PAK6也可以通过雄激素受体-泛素化蛋白连接酶的ser-158与ser-186磷酸化，来调节雄激素受体的降解[17]。研究证明，PAK6与雄激素受体表达呈负相关，PAK6下降则会促进肿瘤进展。近年来有部分研究证明，PAK6在一些癌症，如前列腺癌、结肠癌等中为致癌因子，几乎没有文献研究PAK6在膀胱癌中的表达情况。而p53基因是与人类肿瘤相关性较高的抑癌基因，也是研究广泛的基因之一，他们具有抑制细胞生长和肿瘤形成的功能。研究表明，突变型p53基因对细胞凋亡有一定的抑制作用，人体组织中过量表达的p53蛋白通常都是由p53基因突变而引起的。突变型p53基因目前已经证实了与多种恶性肿瘤的不良预后密切相关。

通过免疫组织化学法对膀胱癌患者的膀胱组织和对照组正常膀胱组织的PAK6蛋白阳性表达率进行检测，发现人膀胱癌组织中的PAK6主要定于细胞质，还有少量的PAK6定于细胞核，而通过数据显示PAK6在膀胱癌组织中表达较低，在正常膀胱组织中表达较高，差异均有统计学意义。根据膀胱癌组PAK6表达与临床病理指标之间得出膀胱癌组复发者的PAK6蛋白阳性表达率(28.13%)相对于原发者(56.60%)较低，提示PAK6与膀胱癌的复发性有一定的关系。而在肾透明细胞癌中，有学者证明，PAK6低表达患者预后不佳，总体存活率与无复发存活率都很低[18-19]。有研究表明，在膀胱癌的发生和进展中雄激素受体信号通路有十分重要的作用，可能会与在膀胱癌中的PAK6的作用有十分密切的关系[20-21]，本研究证明膀胱癌细胞中PAK6表达比正常膀胱癌细胞低，PAK6在膀胱癌发展的过程中具有一定的抑瘤作用，但是，其具体的发生机制以及对膀胱癌的预后影响还有待进一步的研究。为避免在上述研究过程中出现失误，我们又采用实时荧光定量PCR法检测Biu-87、T24膀胱癌细胞以及SV-HUC-1正常膀胱细胞的PAK6 mRNA表达水平来验证上面的实验结果。结果得出Biu-87组、T24组细胞PAK6 mRNA表达水平均低于SV-HUC-1组，差异有统计学意义。结果与前面一致，由此可知，PAK6在膀胱癌中为低表达状态，并且与膀胱癌复发有很密切的关系。

膀胱组的p53蛋白阳性表达率与对照组相比较明显较高，p53在膀胱癌细胞中表达较高，在正常细胞中表达较低。并且，由结果可以看出，p53蛋白阳性表达与膀胱癌临床分期、病理分级等密切相关，还与膀胱癌的复发及转移有很大的联系。正常体细胞p53基因为编码53kD的磷酸结合核蛋白，后者还被称为野生型p53蛋白，野生型p53蛋白通过影响基因的转录，来干扰DNA起始，促进细胞的终末分化程序化死亡，发挥其抑制细胞增殖、转化，进而组织细胞癌变。而p53基因突变产物不仅不会发挥抑癌作用，而且还会促进细胞恶性转化，它的积聚与膀胱癌的分级、肿瘤增殖与进展有密切的联系。而我们在检测膀胱癌细胞中的p53时，检测出的都是突变型p53，而随着肿瘤程度的上升，p53阳性表达率也会逐渐上升。为检验结果，我们用另外3组细胞进行检验，Biu-87组、T24组细胞p53 mRNA表达率与p53 蛋白表达率均高于SV-HUC-1组，与上述结果一致。

综上所述，PAK6在膀胱癌中表达异常，与膀胱癌的发生发展有紧密联系，并且在膀胱癌的复发中有重要作用，PAK6可能会作为新的抑癌指标用以指导临床。本研究也证明了p53在膀胱癌组织以及膀胱癌细胞中有高表达，并且与膀胱癌临床分期等有密切联系，可作为评估膀胱癌预后的标志物。