二年残孔菌菌丝体黄酮提取工艺的研究

鲁 铁，尚浩乐，徐海江，孙冰冰，伍烨菱，张向阳，陈怀中，江 行，郭茗睿，姬晓娜

(1.河南城建学院 生命科学与工程学院，河南 平顶山 467036；2.平顶山健康食品协同创新中心，河南 平顶山 467036)

二年残孔菌隶属于担子菌门、伞菌纲、多孔菌目、皱孔菌科、残孔菌属，多生在苹果树、枫杨、栎以及一些阔叶树上，全世界广布种[1]。二年残孔菌应用领域广泛，子实体拥有多种生理活性物质。国内学者研究表明，该真菌含有抑制肿瘤细胞增殖和胰蛋白酶作用的生物酶类[2]，对肿瘤细胞的凋亡具有一定的诱导作用[3]，且在染料合成[4]、工业脱色[5]等方面具有较大的开发潜力。目前报道对二年残孔菌的研究主要侧重于化学成分及功效、发酵条件的研究，对其活性物质黄酮的提取工艺及优化尚未见报道。黄酮类化合物能够抵抗心律失常和改善冠脉循环，还能够促进胰岛B细胞的恢复，降低血糖和血清胆固醇，改善糖耐量，调节对抗肾上腺素的升血糖作用[6-7]。天然来源的黄酮类化合物是拓宽生药资源的潜在产物。

以二年残孔菌发酵获得菌丝体为实验材料，利用超声辅助醇提法[8]提取其总黄酮，之后采用硝酸铝比色法，以芦丁标准液作为参考，测量提取液在510 nm处的吸光值，利用测得的吸光值绘制芦丁标准曲线，进而计算出黄酮类化合物的含量，并探究超声提取时间、乙醇溶液的浓度和料液比这三个单因素对提取实验的影响，之后利用响应面分析[9]优化确定其最佳的提取条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

所用菌种来自烟台市鲁东大学校园，菌株由野生子实体组织分离所得，菌株编号20110810-12，现保存于河南城建学院平顶山健康食品协同创新中心。菌丝体的发酵条件按文献[10]所示获得，经65 ℃干燥后存储于-20 ℃冰箱备用。

1.1.2 试剂

芦丁分析标准品(≥98%)：合肥博美生物科技有限公司；无水乙醇(≥99.7%)：洛阳市化学试剂厂；硝酸铝(≥99.0%)：天津市科密欧化学试剂有限公司；亚硝酸钠(≥99.0%)：洛阳市化学试剂厂；氢氧化钠(≥96.0%)：洛阳市化学试剂厂。

1.2 仪器

T6新世纪型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；50B型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；JP-100A-2型高速多功能粉碎机；YP102N型电子天平：上海箐海仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 芦丁标准曲线的绘制

分别吸取0 mL、0.2 mL、0.4mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的芦丁标准液，装进小EP管中，各加入5%亚硝酸钠溶液0.15 mL，静置6 min。加入10%硝酸铝溶液0.15 mL，充分摇匀，静置6 min。加入4%氢氧化钠溶液2 mL，继续加入蒸馏水定容至5 mL，震荡摇匀后静置3 min。将制好的溶液放入比色皿中，设定分光光度计的检测波长为508 nm，进行检测。重复三次，得到数据，取其平均值，绘制芦丁标准曲线。

1.3.2 黄酮含量的测定

取干燥后的二年残孔菌菌丝体，置于高速多功能粉碎机中粉碎，摇匀。精确称取1 g二年残孔菌菌丝体干粉，置于50 mL试管中，按照不同的料液比加入不同浓度的乙醇溶液作为溶剂，置于超声波清洗器中进行超声提取。提取后用100目的过滤网过滤，之后滤液用一定浓度的乙醇溶液定容到50 mL，置入50 mL容量瓶中备用。使用时抽取1 mL滤液于1.5 mL的离心管中进行3 600 r/min低速离心3 min，之后抽取使用。

1.3.3 单因素实验设计

(1)乙醇与底物的料液比对提取黄酮的影响:按照提取时间30 min、乙醇质量分数80%。选择不同料液比(115、120、125、130、135)进行黄酮的提取。按照芦丁标准曲线测量黄酮的得率。

1.3.4 响应面实验设计

(1)模型的建立及显著性分析：根据单因素实验所得出的数据，使用Design-Expert8.0软件，选择Box-Behnken实验，以二年残孔菌中的黄酮类化合物的得率为因变量，以料液比、超声提取时间、乙醇的浓度为自变量，进行三因素三水平的响应面分析，来确定二年残孔菌菌丝体中的黄酮类化合物的最佳提取工艺。

(2)响应面的分析：采用Design-Expert8.0软件对二年残孔菌菌丝体中黄酮类化合物提取的实验数据进行线性回归和方差分析。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线实验

标准曲线以芦丁溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。5个浓度所对应的吸光度如图1所示，可以建立回归方程如式(1)所示，其中R2为0.999 2，显示出较高的拟合度。

y=12.121x+0.000 9，R2=0.999 2

(1)

图1 芦丁样品标准曲线

图2 底物与乙醇的料液比对总黄酮得率的影响

样品中总黄酮得率的计算公式[11]：

(2)

其中，C为通过芦丁标准曲线算出来的黄酮质量浓度(mg/mL)；V为提取液体积(mL)；n为稀释倍数；m为称取二年残孔菌菌种的质量(g)。

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇与底物的料液比对二年残孔菌菌丝体中黄酮提取的影响

由图2可以看出：黄酮得率随着料液比的增大而增大。当料液比为125时，黄酮得率为最大值0.592 %。随着料液比超过125时黄酮得率开始下降。起初可能是因为乙醇含量增加使得黄酮类化合物分子与溶剂接触更加充分，黄酮的得率也随之增加，当料液比达到一定的数值时，黄酮的溶出接近饱和，使得溶出的杂质增加，从而使得黄酮的得率下降。选择料液比125为中心点，120、130分别为上下限进行黄酮类化合物提取的响应面优化实验。

2.2.2 乙醇浓度对二年残孔菌菌丝体中黄酮提取的影响

由图3可以看出：乙醇浓度在50%～60%，随着浓度的提高，黄酮得率先增加后减小。当乙醇浓度为60%时，黄酮得率达到最大值为0.643%。而当乙醇浓度超过60%时，黄酮的得率有所下降。可能是乙醇浓度过高，导致细胞内的醇溶性色素和杂质析出，影响吸光度值，从而使得黄酮的得率下降。选择乙醇浓度60%为中心点，50%、70%分别为上下限进行黄酮类化合物提取的响应面优化实验。

2.2.3 超声时间对二年残孔菌菌丝体中黄酮提取的影响

由图4可以看出：随着提取时间的增加，超声波产生的高频率振动和空化效应提高了分子的运动频率，使得更多的黄酮类化合物溶出。当提取时间 40 min时，黄酮得率达到最大值0.553%。提取时间超过40 min时黄酮得率开始下降，可能是因为随着时间的增加，黄酮类化合物的稳定性受到一定的影响，从而导致黄酮得率下降。选择30 min、40 min、50 min进行黄酮类化合物提取的优化实验。选择提取时间40 min为中心点，30 min、50 min分别为上下限进行黄酮类化合物提取的响应面优化实验。

图3 不同浓度乙醇对总黄酮得率的影响

图4 超声提取时间对总黄酮得率的影响

2.3 二年残孔菌菌丝体黄酮提取工艺的响应面实验

2.3.1 响应面结果及分析

表1 响应面实验设计的因素与水平

表2 多因素响应面设计表以及结果

表3 回归方程系数检验表

由表4可知：料液比、乙醇浓度、超声提取时间的一次项对总黄酮的得率达到显著水平(假定值<0.05),同时其二次项影响水平均达到显著水平，其中料液比和超声提取时间的二次项达到了极显著水平(假定值<0.01)；料液比和超声提取时间(AC)交互对总黄酮得率表现为显著，料液比和乙醇浓度(AB)、乙醇浓度和超声提取时间(BC)的交互表现为不显著，其中乙醇浓度和超声提取时间(BC)为最不显著一项。此外从F值可以看出，对二年残孔菌总黄酮得率影响大小排序为：超声提取时间(C)>料液比(A)>乙醇浓度(B)。总方差分析表明，此模型达到极显著水平(假定值<0.1)，失拟项表现为不显著(假定值=0.063 5>0.05)，说明该方程的拟合度良好，能够很好地表现各因素和各个响应值之间的关系，可以用此模型函数化。

经过Design Expert 8.0软件对表中数据进行非线性回归的二次拟合后，得到相应回归方程为：

Y(%)=0.68+0.036A-0.027B+0.05C-0.004AB-0.032AC+0.021BC-0.087A2-0.043B2-0.054C2

(3)

图5 各因素间交互作用对裂褶菌总多糖产量影响的响应面及等高线

图5显示的响应面为从料液比、乙醇浓度、超声时间中取两个变量，一个零水平，反映出两个任意变量对总黄酮提取量的影响。

2.3.2 最佳提取工艺条件

使用Design Expert 8.0软件对回归方程求解，最终得到二年残孔菌提取黄酮最佳工艺为：在料液比125，乙醇浓度60%，提取时间40 min，经过三次平行重复实验测得总黄酮的提取率为0.677%，理论提取率为0.689%，提取较充分。

3 结论

以二年残孔菌发酵培养获得的菌丝体为研究对象，选择使用超声波辅助乙醇提取的方法，并对其进行工艺优化来提取二年残孔菌中的黄酮类化合物。实验通过对乙醇与底物料液比、乙醇浓度、超声提取时间三个单因素进行实验分析，最终得到了二年残孔菌中提取黄酮的最佳单因素条件。在此基础上进行三因子响应面设计，得到最佳提取工艺为：料液比125，乙醇浓度60%，提取时间40 min，最佳总黄酮得率0.677%；对二年残孔菌菌丝体总黄酮得率影响大小排序为：超声提取时间>料液比>乙醇浓度。