秦川牛TNNC2 基因的表达规律研究

杜嘉伟 ，张薇依，李安奇，苏晓彤，杜鑫泽，褚瑰燕，昝林森,2，王洪宝,2*

（1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100；2.国家肉牛改良中心，陕西杨凌 712100）

牛作为家畜饲养已有几千年历史[1]，与猪、鸡相比，牛可以消耗大量的青粗饲料和农副产品，是国家发展节粮型畜牧业的重要畜种。目前，地方黄牛仍然是我国牛肉生产的主要品种，这些品种普遍具有耐粗饲、抗逆性强、肉质细嫩等优点，但存在生长速度慢、胴体产肉少、优质牛肉切块率低、脂肪沉积不理想等缺陷[2]。为增强我国肉牛产业的市场竞争力，育种工作者需充分有效地利用国内现有的黄牛资源优势，通过现代分子育种技术提高肉牛生产性能和改善牛肉生产品质，加快对地方黄牛的改良步伐[3]。

骨骼肌是哺乳动物身体结构中的重要组成部分，参与机体的运动和能量代谢。骨骼肌收缩系统位于肌肉的细肌丝内，该系统主要包括钙蛋白酶复合体（Tropinon，Tn）、纤维蛋白原（Tropomyosim，Tm）和肌动蛋白（Actin）。钙蛋白酶复合体由肌钙蛋白C（TnC）、肌钙蛋白I（TnI）和肌钙蛋白（TnT）3 种亚基组成[4]。研究发现，当人骨骼肌纤维和心脏小梁TnC 蛋白缺失时，肌纤维张力和最大收缩力明显不同，表明TnC 蛋白在肌纤维收缩过程中起着相当重要的作用[5]，而骨骼肌的收缩会影响肌肉的嫩度、剪切力、熟肉率等[4]。TnC 包含TNNC1（Troponin C，Slow Skeletal Muscle）和TNNC2（Troponin C，Fast Skeletal Muscle）2 种蛋白。TNNC2 为骨骼肌快肌肌钙蛋白，已有研究表明该基因与关节远端畸形疾病的发生有着必要的联系，另外该基因还参与心脏信号传导及钙信号传导途径[6]。TNNC2 可通过本身具有的Ca2+结合位点，与Ca2+结合后引起肌肉收缩并释放能量和环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB），CREB 通过启动核内的c-myc 和其他原癌基因单独或协同调控肌蛋白的形成，从而开始肌纤维的生长分化[7]。肌钙蛋白复合物位于横纹肌细丝上，是调节肌肉收缩和松弛的钙敏感开关，它由3 个亚基组成：肌钙蛋白C（TnC），钙结合亚基；肌钙蛋白T（TnT），其主要功能是使复合物与原肌球蛋白结合；肌钙蛋白I（TnI），则属于抑制亚基[8]。目前对于TNNC2基因在农业动物上的研究较少，其在牛上的表达特性和可能功能尚未被阐明，因此本研究选取TNNC2基因为目标基因，以秦川牛为研究对象对其进行深入的功能研究以期用于肉牛的分子育种实践中。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物采样 本实验样本均来自西北农林科技大学国家肉牛改良中心的肉牛良种繁育场，将新生秦川牛（3 日龄）和成年秦川牛（24 月龄）各3 头作为研究对象，屠宰后取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠、瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、肾周脂肪、皮下脂肪、背最长肌等组织，液氮冷冻后转存-80℃冰箱长期保存。新生牛背最长肌组织用于后续成肌细胞的分离培养。

1.1.2 实验器材与仪器设备 10 cm 培养皿（NEST）、1.5 mL/200 μL 离心管（NEST）、PBS 缓冲液（Thermo Fisher）、酒精灯、枪头（Eppendorf）、96孔板封口膜（Thermo Fisher）、Trizol （ThermoFisher）、异丙醇、胰蛋白酶、氯仿、DEPC 水（ThermoFisher）、反转录试剂盒（Takara）、实时荧光定量试剂盒（Takara）、上下游引物（西安擎科）、6 孔板（NEST）等。实时定量PCR 仪（ABI7500）、酶标仪（Tecan Austria GmbH 5082）、通风橱、5811R离心机（Eppendorf）、5424R 离心机（Eppendorf）、制冰机、QL-901 旋涡震荡仪、小型离心机、37℃恒温培养箱以及2.5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL、5 000 μL 定量移液枪等。

1.2 实验方法

1.2.1 秦川牛各组织总RNA 的提取和cDNA 的合成 采用传统的Trizol 法提取各组织的总RNA。提取过程为：取少量组织样于研钵中，加入液氮反复研磨；加入500 μL Trizol，继续研磨混匀后转移至1.5 mL 离心管中，室温放置15 min 后4 ℃、12 000 r/min 离心15 min；取上清，按Trizol 总体积1/5 的量加入氯仿，剧烈振荡15 s 后室温静置5 min；4℃、12 000 r/min 离心15 min；取上清加入等体积的异丙醇充分混匀后室温静置10 min，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min；弃上清，加入1 mL 4℃预冷的75%乙醇，4℃、8 000 r/min离心5 min；室温干燥2～5 min；用适量RNase-free 水溶解RNA，测定浓度后于-80℃保存备用。使用酶标仪（Tecan Austria GmbH 5082）检测所提取总RNA 的纯度及浓度，并使用1% 琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的完整性。以提取的RNA 为模板，按照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒（TaKaRa，code No.RR047Q）操作步骤进行cDNA 的合成。

1.2.2 秦川牛成肌细胞培养及cDNA 样品准备 将秦川牛成肌细胞复苏后采用生长培养基（含体积分数20%的牛血清和体积分数1%的双抗的F-12/DMEM）培养，待细胞长至80%左右融合时使用分化培养基（含体积分数2%的马血清和体积分数1%的双抗的F-12/DMEM）培养，每2 d 更换1 次培养基，于分化第0、2、4、6、8 天取细胞样品，采用Trizol 法提取RNA，并反转录为cDNA[9]。

1.2.3 实时荧光定量PCR 根据GenBank 已公布的牛TNNC2基因序列，利用Primer Premier 5.0 软件设计特异实时荧光定量引物，送交西安擎科有限公司合成。以β-Actin 基因作为内参进行实时荧光定量PCR 反应。PCR 反应体系为20 μL：TB Rreen Ⅱ 7.5 μL（终浓度1X），cDNA 1.4 μL（终浓度100 ng/μL），上下游引物各0.3 μL（终浓度0.2 μmol/L），加RNase free H2O 补足体系。于Bio-Rad 荧光定量PCR 仪（CFX Connect）上进行反应，反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40 个循环；采集熔解曲线荧光信号和达到峰值循环数Ct 值。采用2-△△Ct法对数据进行分析，具体公式为：△Ct1=待测组目标基因Ctmean－待测组β-ActinCtmean；△Ct2=基测组目标基因Ctmean－基准组β-ActinCtmean；RQ=2-(△Ct1-△Ct2)=2-△△Ct，其中，Ctmean代表3 次重复的平均值，RQ（Relative Quantification）值代表实验待测组目的基因的表达相对于基准组变化的倍数[10]。

1.3 统计分析TNNC2基因在不同组织中以及肌细胞不同分化时期的表达差异采用单因素方差分析进行计算，多重比较以表达量最低组织或诱导分化第0 天为对照，使用LSD 方法进行。TNNC2基因在新生牛与成年牛特定组织中的表达差异分析用t检验进行计算，P<0.05 表示差异显著。

表1 实时定量PCR 引物序列

2 结果

2.1 成年牛不同组织TNNC2基因相对表达量的检测本实验中得到的TNNC2基因在成年牛不同组织中的表达量是以肝组织中TNNC2基因的相对表达量作为标准（单位1），计算获得的各组织相对水平，研究结果如图1 所示，TNNC2基因在各组织中广泛表达，但表达量不尽相同。其中TNNC2基因在肝脏中表达量最低，在瘤胃、网胃、肾周脂、肾脏等组织中表达量依次增多，但在这些组织中的整体表达水平依旧较低。该基因在成年牛背最长肌中的表达量极显著高于其他组织。

图1 成年秦川牛TNNC2 基因在不同组织中的表达量

2.2 新生牛不同组织TNNC2基因相对表达量的检测 本实验得到的TNNC2基因在新生牛不同组织中表达量是以肺脏组织中TNNC2基因的相对表达量作为标准（单位1），计算获得的各组织相对水平，结果如图2 所示，TNNC2基因在新生牛肺脏组织中的相对表达量最低，在瘤胃、肾脏、小肠、网胃、大肠、瓣胃、脾脏、肾周脂、皱胃、心脏中的表达量依次增加，但整体处于低表达水平，而在后腿肌和背最长肌中的表达量远远高于其他组织。

图2 新生秦川牛TNNC2 基因在不同组织中的表达量

2.3 成年牛与新生牛重要组织相对表达量的比较 如图3 所示，TNNC2基因在成年秦川牛背最长肌、大肠、肺脏中的相对表达量极显著高于新生秦川牛，在成年秦川牛皮下脂肪、网胃、瓣胃、肾脏、心脏、肾周脂等组织中的表达量显著高于新生秦川牛，而在瘤胃和脾脏中表达差异不显著。

图3 成年牛与新生牛重要组织相对表达量的比较

2.4TNNC2基因在成肌细胞不同分化天数的表达规律的测定TNNC2基因在成肌细胞诱导分化不同天数的相对表达量是以第0 天作为标准得出的结论。由图4 可知，从整体趋势上来看，TNNC2基因在成肌细胞分化过程中的表达量是上升的，但在第6 天TNNC2基因的表达量稍有下降，该基因的表达趋势与成肌细胞的分化程度相一致，由此推测TNNC2是与肌细胞分化相关的基因，后续研究可聚焦于其对于牛肌细胞增殖分化的影响。

图4 TNNC2 基因在肌肉细胞不同天数的表达规律

3 讨 论

目前，有关TNNC2基因功能的研究文献很少，已有研究证实TNNC2基因不仅对肌肉发育有影响，同时还与一些疾病的发生相关。如TNNC2基因与人类的先天性肌病有关，当TNNC2基因发生显性突变时将伴有声带麻痹及眼肌麻痹等临床症状[11]。另外，在女性妊娠过程中，TNNC2基因突变将引起呼吸系统受损、羊水过少等临床症状[12]。农业动物上的研究发现，TNNC2可以作为一个猪肉品质相关的候选基因[13]。绵羊上的研究表明，TNNC2基因不同基因型与绵羊肉的剪切力、大理石纹评分显著相关，说明TNNC2 等位基因对绵羊肉嫩度有正向影响[14]。

本实验主要采用qRT-PCR 技术检测了TNNC2基因在新生秦川牛和成年秦川牛不同组织中的表达模式，同时检测了该基因在成肌细胞诱导分化后不同天数的表达规律，研究结果初步揭示了TNNC2基因的表达特性及规律。无论在新生牛还是成年牛中，TNNC2在背最长肌中的表达量都极显著高于其他组织，其在成年牛背最长肌中的表达量约为新生牛的3 倍，说明其对肌肉的生长发育可能具有重要的调控作用。除了肌肉组织（骨骼肌和心肌），TNNC2在新生牛其他组织中的表达水平都很低，进一步证实了该基因与肌肉发育可能存在密切关系。随着秦川牛的生长发育，TNNC2基因在各个组织中的表达量均有所提高，但整体表达水平依然不高，推测其可能原因是内脏组织（如脾、肾等）均为非肌肉组织，TNNC2不参与其行使功能。有意思的是，TNNC2基因在成年牛肺脏中的表达水平极显著高于新生牛，提示该基因可能与牛的呼吸功能有关，这与Donkervoort 等研究结果一致[12]。TNNC2基因在新生牛和成年牛大肠中的表达量差异极显著，可能的原因还需进一步研究。

本研究得到了TNNC2基因在成肌细胞分化不同天数的表达规律：从总趋势上来看，虽然在分化至第6 天时TNNC2基因的表达量稍有下降，但TNNC2在成肌细胞分化过程中的表达量整体呈上升趋势，提示该基因可能促进肌细胞的分化，可尝试在肌细胞中对该基因进行过表达或干扰，进一步阐明其对牛肌细胞增殖和分化的影响。

4 结 论

本研究发现，TNNC2基因在秦川牛快肌组织（如背最长肌、后腿肌等）中的表达水平显著高于其他组织，同时随着牛成肌细胞的不断分化，该基因的表达水平逐渐升高，推测TNNC2基因对秦川牛骨骼肌的生长发育具有重要的调控作用，可将其作为影响肉牛生长和肉质性状的候选基因加以深入研究。