柚皮苷对3T3-L1 脂肪细胞凋亡的影响

霍子东，王 琪，蒋亚东，李泽强，王 敬，肖 融*

（1.甘肃省畜牧技术推广总站，甘肃兰州 730030；2.重庆市畜牧科学院，重庆 602460；3.重庆市璧山区大兴镇农业服务中心，重庆 402760；4.泸州市现代农业发展促进中心，四川泸州 646000）

柚皮苷（Naringin）全称4,5,7-三羟基-黄烷酮-7-鼠李糖葡萄糖苷，是一种二氢黄酮类化合物，天然存在于芸香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中[1]。柚皮苷具有抗炎[2]、抗氧化[3]和调控脂肪代谢[4]等多种生物学功能，在医学领域和畜禽生产中均有较好的应用价值。脂肪代谢及脂肪调控对于维持动物健康和改良畜禽肉品质具有十分重要的意义。柚皮苷作为一种新型饲料添加剂，能减少动物脂肪沉积。Hagertheodorides 等[5]在Ross308 肉鸡饲料中添加柚皮苷，发现腹部脂肪重量显著下降，且胸肌中棕榈酸含量降低，多不饱和脂肪酸含量升高。体外试验也发现柚皮苷可抑制3T3-L1 脂肪细胞的增殖和成脂分化[6-7]，但其是否通过促进脂肪细胞凋亡来减少脂肪沉积的作用机制尚不明确。因此，本试验用不同浓度柚皮苷处理3T3-L1 前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞，探讨柚皮苷对脂肪细胞凋亡的影响，为柚皮苷在畜牧生产中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料 3T3-L1 前体脂肪细胞购自中科院上海细胞库；DMEM/F12 培养基和胎牛血清购于Gibco 公司；胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松和罗格列酮购自Sigma 公司；柚皮苷（纯度≥98.0%）购自索莱宝公司；hoechst 染色试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；Binding Buffer 缓冲液、Annexin-V 和PI 购自里来生物科技有限公司；RNA 提取试剂和RT-PCR 反应试剂盒购自TaKaRa 公司；RIPA 裂解液和BCA 试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；5×SDS 上样缓冲液、Bax 抗体、APAF-1 抗体、GAPDH 抗体和山羊抗兔二抗购自Cell Signaling Technology 公司；12%SDS-PAGE胶购自invitrogen 公司；ECL 化学发光试剂盒购自biobad 公司。

1.2 3T3-L1 细胞培养与诱导分化 3T3-L1 前体脂肪细胞常规复苏后，用DMEM 高糖培养基（含10%胎牛血清），在37℃，体积分数5% CO2的培养箱中培养。为诱导分化，当细胞完全融合后，将培养基换为分化培养基（即DMEM 培养基中含5 μg/mL 胰岛素，0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，1 μmol/L 地塞米松，1 μmol/L罗格列酮和10%胎牛血清）。2 d 后，换为维持培养基（即DMEM 培养基中含5 μg/mL 胰岛素和10%胎牛血清），每2 d 更换1 次培养基，共诱导分化8 d 后，在显微镜下观察，细胞周围已形成明显脂滴，即已将前体脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞[8]。

1.3 柚皮苷处理 前体脂肪细胞（未分化）和成熟脂肪细胞（分化细胞）均培养在DMEM 高糖培养基中（含10%胎牛血清），并分别在其培养基中加入不同浓度（0、50、200、600 μmol/L）柚皮苷，0 μmol/L 为对照组，处理24 h 后用于试验检测，每组设3 个重复。

1.4 Hoechst 染色 根据试剂盒说明书进行操作，用固定液固定脂肪细胞10 min，去掉固定液后用PBS 清洗2 次。加入Hoechst 33258 染色液，染色5 min，去掉染色液后用PBS 清洗2 次后即置于荧光显微镜下观察拍照，激发波长为350 nm。

1.5 流式细胞仪检测脂肪细胞凋亡率 收集脂肪细胞后，加入500 μL Binding Buffer 缓冲液重悬细胞，加入5 μL Annexin-V、5 μL PI 混匀，避光孵育10 min 后上流式细胞仪检测。

1.6 荧光定量PCR 检测凋亡因子mRNA 表达 RNA 的提取参照试剂盒说明书，提取的RNA 经过浓度和纯度检测后，参照反转录试剂盒说明书进行反转录为cDNA。根据GenBank 中的基因序列设计引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成（表1），GAPDH为管家基因。按照TaKaRa 荧光定量PCR 试剂盒（SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ）和Real-Time PCR System 的使用说明进行荧光定量PCR 反应。反应体系20 μL：SYBR qPCR Mix 10 μL，cDNA 4 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ROX reference Dye Ⅱ 0.4 μL，ddH2O 4 μL。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火34 s，共40 个循环。采用2-△△CT法计算基因的相对表达量。应用SPSS17.0 软件对试验数据进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），P<0.05 表示差异显著。

1.7 Western blotting 测定凋亡因子蛋白表达 使用RIPA 裂解液提取总蛋白。用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以5×SDS 上样缓冲液与蛋白样品1:4 比例混合，金属浴100℃中5 min 使蛋白完全变性，上样。12%的SDS-PAGE 胶进行蛋白分离，然后转印到0.22 μm PVDF 膜上，5% 脱脂奶粉室温封闭2 h 后加封闭液配置的一抗4℃孵育过夜，TBST 洗膜5 次后，加入封闭液配置的二抗室温孵育1 h 后洗膜3 次。最后用ECL 化学发光试剂盒和自动发光曝光仪进行显色拍照分析。

2 结果

2.1 柚皮苷对脂肪细胞凋亡的影响 由图1 所示，柚皮苷处理未导致前体脂肪细胞凋亡。在成熟脂肪细胞中，柚皮苷处理导致细胞呈致密浓染，细胞核颜色呈亮白色增多，表明柚皮苷引起了成熟脂肪细胞凋亡；与200、600 μmol/L 柚皮苷组相比，50 μmol/L 柚皮苷组的细胞凋亡特征更明显。

表1 荧光定量PCR 引物序列

流式细胞仪检测细胞凋亡率的结果与hoechst 染色结果基本一致。柚皮苷处理几乎未引起前体脂肪细胞凋亡率升高。在成熟脂肪细胞中，添加不同浓度柚皮苷均上调了细胞凋亡率，且50 μmol/L 柚皮苷处理导致的细胞凋亡率更高（图2）。从脂肪细胞形态和脂肪细胞凋亡率两方面看，柚皮苷处理导致了成熟脂肪细胞诱凋亡，而未引起前体脂肪细胞凋亡。

2.2 柚皮苷对脂肪细胞凋亡因子mRNA 表达的影响 荧光定量PCR 结果表明（图3），柚皮苷对前体脂肪细胞中凋亡基因的表达无显著影响。与对照组相比，50 μmol/L 柚皮苷显著上调了成熟脂肪细胞中促凋亡因子Bax、Bcl-2、PARP和APAF-1的mRNA 表达量。200、600 μmol/L 柚皮苷处理对上述促凋亡因子的mRNA 表达无显著影响。

2.3 柚皮苷对脂肪细胞凋亡因子蛋白表达的影响 由图4 可见，柚皮苷处理几乎未导致前体脂肪细胞中促凋亡蛋白表达的变化，仅600 μmol/L 柚皮苷处理对Bax 和APAF-1 的蛋白表达水平有一定程度的上调。在成熟脂肪细胞中，添加不同浓度柚皮苷均不同程度地上调了Bax 和APAF-1 的表达，且50 μmol/L 柚皮苷处理的作用最强。

图1 柚皮苷对脂肪细胞凋亡的影响

图2 柚皮苷对脂肪细胞凋亡率的影响

图3 柚皮苷对脂肪细胞凋亡因子mRNA 表达的影响

图4 柚皮苷对脂肪细胞凋亡因子蛋白表达的影响

3 讨 论

柚皮苷作为一种新型饲料添加剂，能减少动物脂肪沉积，抑制3T3-L1 前体脂肪细胞增殖分化[9]，但目前柚皮苷与脂肪细胞凋亡之间的调控关系还不明确。现有研究表明，与柚皮苷类似的一些天然活性物质能促进脂肪细胞凋亡。Singh 等[10]研究发现，千层纸素A 抑制了3T3-L1 前体脂肪细胞增殖，可能与诱导了前体脂肪细胞凋亡有关；千层纸素A 还减少了成熟脂肪细胞内的脂质积累，并通过刺激促凋亡蛋白Bax、细胞色素C（CYTC）和细胞凋亡诱导因子（AIF）的表达来诱导细胞凋亡。此外，染料木黄酮也能促进前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞凋亡[11-12]。千层纸素A 和染料木黄酮都属于黄酮类物质，本试验中柚皮苷也是一种黄酮类物质，但柚皮苷仅诱导了成熟脂肪细胞凋亡并促进了相关促凋亡因子的表达，而未引起前体脂肪细胞凋亡；表明即使同属黄酮类物质，但由于分子结构等不同，使得它们对脂肪细胞凋亡的影响也不完全一致。Lin 等[13]也发现儿茶素能增加成熟脂肪细胞凋亡，而不影响前体脂肪细胞的生存能力，说明同一物质对不同分化状态的脂肪细胞具有差异的调控作用。此外，Guo 等[7]研究发现柚皮苷可显著抑制3T3-L1 前体脂肪细胞增殖，但其并未就柚皮苷是否通过诱导前体脂肪细胞凋亡进而抑制细胞增殖进行深入研究，而本试验结果表明柚皮苷处理未导致3T3-L1 前体脂肪细胞凋亡，提示柚皮苷对3T3-L1 前体脂肪细胞增殖的抑制作用不是通过诱导细胞凋亡来实现的。

黄酮类天然活性物质作用于细胞凋亡过程中的多个基因和信号通路。柚皮素通过降低抗凋亡蛋白苏氨酸激酶（p-Akt）的表达以及增加促凋亡蛋白Bax 表达，从而促进人脂肪前细胞系AML-I 细胞凋亡[14]。另有试验证明，人参皂苷Rh2 通过Akt/Bax/caspase9 途径诱导急性早幼粒白血病细胞系NB4 细胞凋亡[15]。本试验发现，柚皮苷上调了Bax mRNA 和蛋白表达水平，提示柚皮苷可能通过Akt/Bax 途径诱导脂肪细胞凋亡。此外，纳曲酮能激活Bax/Bcl-2/caspase-3/PARP 信号通路诱导巨噬细胞凋亡[16]。Kwak 等[17]研究表明，甘草查耳酮通过影响促凋亡因子Bax、Bcl-2、CYTC、APAF-1 和PARP 等的蛋白水平，进而诱导食管鳞癌细胞凋亡。虽然与上述研究中的细胞类型有差异，但本研究中柚皮苷通过提高Bax、Bcl-2、APAF-1和PARP的表达水平诱导成熟脂肪细胞凋亡的试验结果与上述研究结果类似。研究还发现，黄酮类物质的抗脂肪沉积作用与AMPK通路和Wnt 通路活化诱导的脂肪细胞凋亡有关[18-20]，但柚皮苷对上述信号通路的调控作用尚需进一步探究。

4 结 论

本研究结果表明，50、200、600 μmol/L 柚皮苷处理未导致3T3-L1 前体脂肪细胞凋亡；50 μmol/L 柚皮苷能通过上调促凋亡因子Bax、Bcl-2、PARP和APAF-1的mRNA 表达以及Bax 和APAF-1 的蛋白表达来诱导3T3-L1 成熟脂肪细胞凋亡，进而减少动物脂肪沉积。