外泌体调控哺乳动物妊娠作用的研究进展

华仁武，雷明刚,2,3*

（1.华中农业大学动物科学技术学院、动物医学院，湖北武汉 430070；2.农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，湖北武汉 430070；3.农业部猪遗传育种重点实验室，湖北武汉 430070）

外泌体是指细胞向胞外分泌并能介导细胞间交流的杯盘状囊泡类小体[1-2]。最初于2006 年发现在女性血液中特异分离的胎盘外泌体在妊娠免疫中起重要作用[3]，于2007 年又发现外泌体可以携带生物信息（miRNA 和mRNA）来介导细胞间的交流[4]，外泌体的功能及其在妊娠过程中发挥的作用得到了初步探索。自此之后，在人[5]、鼠[6]、牛[7]、羊[8]、猪[9]中都发现了外泌体与妊娠相关，来源于胚胎[10]、胎盘[11]、子宫内膜[12]等的外泌体可以介导母体-胚胎交流，并在妊娠过程中发挥着重要作用[13]。近年来，已经有越来越多的学者开始关注外泌体在妊娠发生和发展过程中的作用及其机制。本文主要针对外泌体的特性及其在哺乳动物妊娠过程中的功能和调控机制进行综述，提供更加全面的视角了解妊娠生理学及其病理学。

1 外泌体

1.1 特征 外泌体是细胞向胞外分泌的囊泡类小体，直径为20～200 nm[1-2]，具有典型的脂质双分子层膜结构，密度为1.13～1.19 g/mL，有典型的“杯盘”形态[14-15]，存在于细胞培养上清液、血浆、血清、唾液、尿液、子宫液、羊水和恶性腹水以及其他生物体液中[16]。外泌体的功能是通过传递信息到其他细胞中来影响受体细胞[17]。

来源不同的外泌体有不同的结构蛋白和脂质并且携带着不同的分子货物，最常见的外泌体结构蛋白质主要包括四跨膜蛋白（如CD63、CD9 和CD81）、热休克蛋白（如Hspa8、Hsp90）、GTP 酶（如EEF1A1、EEF2）、蛋白质标记物（如Alix）[2]。脂质膜是由胆固醇、甘油二酯、鞘脂、磷脂、甘油磷脂和聚甘油磷脂组成[18]。分子货物主要包括mRNA、DNA、非编码RNA等生物学信息[3-4,19]，其中miRNA 在对生殖轴和胚胎着床有重要影响[20]。

1.2 外泌体的释放和吸收

1.2.1 外泌体的释放 外泌体经过一系列的过程从细胞内释放（图1）。首先，使质膜内陷以形成早期内体（Early Endosomes），其次将有效负载出芽到内泌体膜中以形成多泡内泌体，其中通过转运所需内体分选复合物（Endosomal Sorting Complexes Required For Transport，ESCRT）进行分选是分子有效负载填充至多泡内泌体的机制[21]，晚期内体（late endosomes）通过酸化成熟，最终其成熟后与质膜的融合释放外泌体[15]。

1.2.2 外泌体的吸收 外泌体作用受体细胞有融合、内吞吸收、配体-受体反应和囊泡内容物释放4 种方式（图2）[2]。

1.2.3 外泌体释放调控 细胞受到外在刺激（如低氧、氧化应激、剪应力）会导致释放的外泌体增加，细胞内因子也会影响外泌体的释放，其中包括细胞质钙离子的增加和细胞骨架的降解[22]。

图1 外泌体的释放（改编于文献[16]）

图2 外泌体的吸收（改编于文献[2]）

2 外泌体对妊娠的影响

外泌体存在于人、小鼠、牛、羊、猪等哺乳动物的子宫中。在子宫内，外泌体主要来源于子宫、胚胎和胎盘。来源不同的外泌体在哺乳动物的妊娠识别、胚胎附植、免疫调控、胚胎发育、分娩等过程发挥着不同的作用[13,16-17]。

2.1 外泌体对人妊娠的影响 在人上，已经发现子宫内膜、早期胚胎、胎盘都可以释放外泌体，进而影响妊娠过程。Ng[12]研究发现，子宫内膜细胞外泌体miRNA 通路富集主要和胚胎附植相关，并且发现hsa-miR-200c、hsa-miR-17 和hsa-miR-106a 在外泌体中含量最高；Vilella 等[5]实验证明，人子宫内膜细胞释放的外泌体包裹的Hsa-miR-30d 可以被小鼠胚胎吸收，能在胚胎附植期间影响胚胎的黏附。以上2 个实验表明，子宫内膜可以释放包裹miRNA 的外泌体并被胚胎吸收进而来影响胚胎附植。另外，Giacomini 等[10]研究发现，人胚胎体外培养液中的外泌体可以被母体吸收，这表明胚胎外泌体也可以传递到母体子宫内膜中。

就胎盘外泌体而言，Salomon 等[23]发现血清中胎盘外泌体在妊娠第一期（最后经期第1 天之后第3～12 周）、第二期（第12～24 周）和第三期（第24～40 周）浓度会逐渐升高，并且能促进内皮细胞迁移；Hadley 等[24]发现羊膜上皮细胞在氧化应激下可以促进外泌体的释放，并且可以影响子宫肌层细胞和蜕膜化细胞炎症因子分泌并激活其NFκB 通路。在妊娠中期羊水中的外泌体富含可调控免疫功能的热休克蛋白HSC72[25]；胎盘外泌体可以调控母体免疫细胞并与免疫耐受相关[26-27]。在妊娠后期，胎盘的合体滋养层是外泌体的主要来源，合体滋养层可以释放外泌体进入母体血液，构建了一个重要的胎儿和母体之间的信号传递机制[28]。以上研究说明，胎盘外泌体在人妊娠过程中会不断增加并与免疫调控和母体-胎儿的信息交流相关。

2.2 外泌体对小鼠妊娠的影响 已有研究运用小鼠模型进行外泌体体内试验来研究其在妊娠中的影响，试验发现体外胚胎培养液的外泌体可以提高小鼠的胚胎附植率，并且增加小鼠囊胚细胞增殖能力，并减少细胞凋亡[29]；Sheller-Miller 等[30]运用小鼠模型，在小鼠妊娠16～17 d 时将荧光染色外泌体注射到子宫内，发现外泌体可以被胚胎和母体吸收。该团队将妊娠第18 天的母体血浆外泌体腹腔注射到妊娠第15 天的小鼠中可以增加小鼠早产率，表明外泌体可以介导与分娩相关的旁分泌信号并且诱导分娩[31]。以上体内实验表明外泌体在小鼠妊娠过程中可介导母体-胎儿的信息交流并调控其胚胎附植和分娩。

在体外实验上，已经证实胚胎可以通过外泌体与母体免疫系统交流[32]；细胞外囊泡中的miR-21 可以对受精卵和胚胎的发育有促进作用[33]；hnRNPC1 可以影响子宫内膜细胞释放外泌体中的miR-30d 的含量影响胚胎附植[6]。以上体外实验表明外泌体可以影响鼠的免疫调控、胚胎发育和胚胎附植。

值得关注的是，Sheller-Miller 等[34]通过转基因小鼠等技术表明来源于母体带有荧光标记的外泌体可以穿过胎盘运送至胚胎组织并使其发生改变，且外泌体在怀孕期间可作为胎儿功能的生物标志物及药物和其他货物的载体，这项研究为体内胚胎治疗提供了一个新的有效途径。

2.3 外泌体对牛妊娠的影响 在牛上，主要是通过提取子宫腔液和外周血外泌体进行测序以及进一步实验来了解其功能和调控机制。Kusama 等[35]对妊娠17、20、22 d 的牛子宫腔液外泌体做蛋白组测序，后用其处理滋养层CT1 和子宫内膜上皮细胞检测mRNA 水平变化，发现外泌体处理子宫内膜上皮细胞可以导致凋亡相关因子和黏附相关基因mRNA 表达水平发生变化；该团队还针对妊娠15、17 d 与空怀15、17 d 蛋白组测序子宫腔液外泌体发现CAPG、AKR1BI 和IFNT 仅在妊娠期表达，推测该蛋白是由胚胎释放到子宫腔液中，并推断外泌体不仅来源于子宫内膜同时也来源于胚胎[36]。从而可以得知，在牛妊娠早期，子宫腔液包含母体和胚胎释放的外泌体，这些外泌体能够影响子宫内膜上皮细胞的mRNA 表达水平。

在外泌体调控机制的研究上，Zhao 等[7]对妊娠0 d 和60 d 的牛外周血外泌体做测序，筛选出BtamiRNA-499 在妊娠60 d 特异性高表达，它可以通过靶向Lin28B 进而调控NFκB 来影响相关炎症因子（TNFα和IL-6 等）表达量的变化，进而影响妊娠。在牛体外研究上的结果表明，牛子宫内膜释放的外泌体可以增加体细胞核转移囊胚的形成率和孵化率[37]，并且子宫内膜间质细胞在低氧应激下能促进外泌体的释放[38]。以上表明，外在刺激可以影响外泌体的释放，并且外泌体在牛妊娠过程中与免疫调控、胚胎发育相关。

2.4 外泌体对羊妊娠的影响 在羊上，已有研究将羊作为模型用于与外泌体相关的体内试验。Burns 等[39-40]发现，羊子宫分泌的外泌体可以在体内被胚胎和子宫内膜吸收；同时在体外也可以被子宫内膜细胞和滋养层细胞吸收，并对妊娠14 d 和正常月经第14 天的羊子宫腔液细胞外囊泡mRNA、miRNA 和蛋白组测序来分析早期妊娠中mRNA、miRNA 和蛋白质表达量的变化。这些研究表明外泌体可以在胚胎-母体交流过程中传递mRNA、miRNA 和蛋白组等生物信息。该团队还发现孕激素处理后可以提高子宫腔液中外泌体的释放量，将孕激素处理后的子宫腔液外泌体做一个miRNA 测序，来研究孕激素对外泌体成分的影响[41]。Duckett 等[42]研究发现，在羊妊娠中期血清中外泌体活力（用乙酰胆碱酯酶含量代表）会保持稳定，但是在妊娠第133 天会降低。因此，外泌体的释放可以受到孕激素的调控，并且血清中外泌体的含量在妊娠期间会发生变化。

在羊上，也发现外泌体与胚胎的发育相关。Cleys等[43]对血清、脐血清和胎盘外泌体样本提取miRNA 进行测序，通路分析发现血清外泌体miRNA 靶向细胞生长和增殖以及器官发育通路；同时，脐血清和胎盘外泌体miRNA 靶向细胞、生物和胚胎发育信号通路。

值得关注的是，子宫内膜释放包含内源性逆转录病毒的外泌体，可以通过TLR 介导进而影响孕体IFNT的分泌，这是反刍动物妊娠识别的信号；同时外泌体影响滋养外胚层细胞的增殖[8]。这表明外泌体与早期妊娠识别信号相关。

2.5 外泌体对猪妊娠的影响 在猪上，已经有研究分离出猪子宫腔液中的细胞外囊泡并分析其中miRNA 表达量的变化。Krawczynski 等[44]发现子宫腔液中细胞外囊泡中miR-125b 在妊娠14 d 和16 d 差异表达，并且miR-125b 在子宫内膜上皮细胞中可以调控能影响胚胎发育和附植的重要基因的表达；Bidarimath 等[9]在猪母胎界面观察到细胞外囊泡的存在，然后提取猪胚胎滋养层细胞和内皮细胞的培养液外泌体进行蛋白测序分析，并且观察到2 类细胞可以吸收另一方释放的外泌体。研究结果可以说明，在猪妊娠早期，外泌体可以携带miRNA 和蛋白质来介导胚胎-母体的信息交流。

在体外实验上，Bai 等[45]使用精液外泌体处理猪子宫内膜上皮细胞，通过mRNA 测序，发现猪精液外泌体会诱导子宫内膜上皮细胞免疫相关基因mRNA 水平的表达；Saadeldin 等[46]发现孤雌胚胎培养液的外泌体处理克隆胚胎会提高其发育能力。以上研究结果说明，精液外泌体可以影响子宫内膜细胞，胚胎之间也可能通过外泌体进行信息传导。

3 结 语

在近十几年里，外泌体领域研究正在快速发展并在不断探索其在生理上和病理上的功能。外泌体在妊娠过程中发挥着重要作用，在子宫内，来源于胚胎、胎盘和母体子宫内膜的外泌体可以通过传递蛋白质、mRNA、非编码RNA 等生物学信息给受体细胞进而影响妊娠。外泌体是一种胚胎和母体环境之间的直接和动态交流方式，它们可以释放外泌体并能吸收另一方释放的外泌体。但是，哪类外泌体在妊娠过程中发挥“主效作用”及其在子宫内精确靶向机制依然有待研究。

外泌体在妊娠识别、胚胎附植、免疫调控、胚胎发育、分娩等过程中都发挥了重要的作用。在妊娠识别过程中，外泌体与早期妊娠识别信号相关，并且血清中胎盘外泌体的含量在妊娠过程中会发生变化。然而，是否可以通过精确定量检测外泌体及其内容物含量对家畜的早期妊娠进行判断并运用到生产实践中，依然有待研究。在胚胎附植过程中，子宫内膜以及体外培养的胚胎都可释放外泌体来促进胚胎黏附，进而来影响胚胎附植。就免疫调控而言，胎盘外泌体可以通过激活NFκB 通路来影响母体炎症因子的表达量，并且可以调控母体免疫细胞和促进免疫耐受。在胚胎发育过程中，子宫内膜、孤雌胚胎和胎盘可以释放外泌体来刺激体外胚胎的发育，并且外泌体可以作为小鼠胚胎的有效药物载体；外泌体在未来有望成为其他大型哺乳动物胚胎的药物或者其他货物的载体进而对胚胎进行靶向给药以及靶向补给。就分娩而言，外泌体可以作为分娩的旁分泌的介质进而来诱导分娩。总而言之，外泌体对哺乳动物妊娠过程有着重要影响，进一步的研究可以更好地明确不同来源的外泌体在妊娠过程中的作用机理。