三阴性乳腺癌组织中DSN1的表达变化及其与预后的关系

全秀莲，朱金明，陈曦，张宇，冀学宁

大连大学附属中山医院，辽宁大连 116001

三阴性乳腺癌是指HER-2、雌激素和孕激素受体均为阴性的乳腺癌，其恶性程度高，侵袭能力强，临床治疗效果差，是预后最差的乳腺癌类型，严重威胁患者生命健康[1]。因此，迫切需要明确三阴性乳腺癌潜在的分子机制，并寻找新的生物靶标，改善临床结局。90%肿瘤存在染色体结构或数目的异常改变，这种现象又被称为染色体不稳定，有些甚至出现在癌前病变和原位癌阶段，这有利于肿瘤的恶性转化及侵袭转移[2]。DSN1是动粒蛋白结构核心成分，在细胞有丝分裂过程中连接纺锤体与染色体，精准调控染色体分离过程[3]。研究[4,5]表明，DSN1与细胞恶性转化和肿瘤进展有关，可影响肿瘤的细胞周期和生物学复制过程。但DSN1在乳腺癌中的表达和功能仍不清楚。本研究观察了三阴性乳腺癌组织中DSN1的表达情况，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择我院2012年1月～2015年12月接受手术切除的120例三阴性乳腺癌患者。患者均为女性，年龄(46.7±11.3)岁，BMI≥28 kg/m267例、<28 kg/m2为53例，肿瘤直径<2 cm 39例、≥2 cm 81例，组织学类型中浸润性导管癌91例、浸润性小叶癌9例、髓样癌3例、其他17例，有淋巴结转移71例、无淋巴结转移49例，TNM分期Ⅰ+Ⅱ期53例，Ⅲ+Ⅳ期67例，远处转移18例、无远处转移102例。所有患者经两位病理医师首次明确诊断为三阴性乳腺癌且术前未接受化疗或放疗。纳入标准：患者除患乳腺癌外，不存在其他部位的恶性肿瘤；心肝肾功能能耐受手术；存在完整的临床病历资料和随访信息；不存在任何遗传性疾病。本研究通过医院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2 三阴性乳腺癌组织中DSN1检测方法 手术切除所有患者肿瘤组织，石蜡包埋，用甲醛固定切成4 μm切片，脱蜡并在梯度乙醇中再水合。在pH6.0的乙二胺四乙酸缓冲液中煮沸切片3 min进行抗原修复。用3%过氧化氢淬灭内源过氧化物酶活性30 min。使用兔单克隆抗DSN1抗体(ab184441，Abcam，Cambridge，UK)在4 ℃下将TMA载玻片染色过夜，再与辣根过氧化物酶缀合的抗兔二抗(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)在37 ℃温育30 min。然后使用辣根过氧化物酶和3,3′-二氨基联苯胺色原溶液处理载玻片并用苏木精复染。采用阳性染色细胞的百分比结合染色强度半定量地对DSN1表达进行评分。染色强度阴性计为0分，弱阳性计为1分，中度阳性计为2分，强阳性计为3分。DSN1阳性细胞的百分比占0～10%计为1分，>10%～50%计为2分，>50%～80%计为3分，>80%计为4分。将两者得分相乘，≤3为DSN1低表达，≥4为DSN1高表达。

1.3 随访方法 采用定期返院复诊及电话进行随访，术后半年内每2个月复诊1次，半年后每3个月复诊一次，每月电话随访1次。记录所有患者的总生存时间(从手术到患者死亡的时间；如患者健在，则为从手术到最后一个随访日的时间)及无瘤生存时间(从手术到首次随访发现复发或随访截止日之间的时间)。计算5年无瘤生存率(术后5年未复发的患者人数/总患者人数×100%)和5年总生存率(术后5年仍健在的患者人数/总患者人数×100%)。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法和Cox比例风险模型分析三阴性乳腺癌患者癌组织中DSN1表达与患者预后关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三阴性乳腺癌组织中DSN1的表达情况 三阴性乳腺癌组织中DSN1蛋白阳性染色主要定位于细胞质。120例患者中75.8%(91/120)DSN1高表达、24.2%(29/120)DSN1低表达。

2.2 DSN1表达与三阴性乳腺癌临床病理特征的关系 结果见表1。

2.3 DSN1表达与三阴性乳腺癌预后的关系 DSN1高表达者5年无瘤生存率和总生存率分别为12.4%(11/91)、18.7%(17/91)，DSN1低表达者5年无瘤生存率和总生存率分别为17.2%(6/29)、24.1%(7/29)，DSN1高表达者无瘤生存率和总生存率均低于DSN1低表达者(P均<0.01)。

单因素Cox回归分析显示，DSN1表达、TNM分期、淋巴结转移和远处转移与三阴性乳腺癌患者无瘤生存率有关(P均<0.05)；多因素Cox回归分析表明，DSN1表达(HR=1.091，95%CI：1.082～3.75，P=0.001)是三阴性乳腺癌患者无瘤生存率独立预测因子；见表2。

单因素Cox回归分析显示，DSN1表达、TNM分期与三阴性乳腺癌患者总生存率有关(P均<0.05)；多因素Cox回归分析表明，DSN1表达(HR=1.887,95%CI：1.591～4.528,P=0.003)、TNM分期(HR=1.368，95%CI：0.577～2.734，P=0.013)可作为三阴性乳腺癌患者总生存率的预测因子；见表3。

表1 DSN1表达与三阴性乳腺癌临床病理特征的关系(例)

3 讨论

三阴性乳腺癌ER、PR受体和HER-2存在表达缺陷，内分泌和靶向治疗效果差，该型肿瘤侵袭力强，传统治疗效果欠佳，是乳腺癌治疗领域的难点[2,6,7]。癌症的出现是遗传与环境共同作用的结果，染色体的异常改变是肿瘤出现的常见原因[2]。染色体的适当分离对于遗传物质的传递十分重要，动粒蛋白为染色体分离提供动力，精准时序调控染色体分离过程；DSN1是人体细胞有丝分裂中动粒蛋白组装所必需的蛋白，动粒组装是染色体分离的关键步骤，对细胞周期进展十分关键[8]。

最近研究表明，DSN1与细胞恶性转化和肿瘤进展有关[5]。研究发现，原发性肝细胞癌组织中64.2%呈现DSN1高表达，35.3%呈现DSN1低表达[4]。亦有报道肺癌组织中DSN1存在高表达现象[9]。本研究发现，120例三阴性乳腺癌患者中75.8% DSN1高表达，24.2% DSN1低表达。这些研究结果说明，在肝癌、肺癌、乳腺癌组织都出现了DSN1高表达，提示DSN1有可能成为新的肿瘤标记物，为临床肿瘤的诊治提供新的思路。

研究发现，DSN1与肝癌[4]、肺癌[9]、结肠癌[3]的恶性转化和肿瘤的侵袭进展密切相关。有文献[4]报道,在肝细胞癌患者中，DSN1高表达可为肝细胞癌术后总生存率的独立危险因素。有学者检测了结直肠癌癌组织和癌旁组织中基因的表达差异，发现DSN1高表达且可区分正常结肠组织和癌变组织，但其并未探讨DSN1高低表达对结直肠癌患者预后的影响[3]。本研究发现三阴性乳腺癌组织中的DSN1表达与TNM分期和淋巴结转移有关，与年龄、肥胖、肿瘤直径、组织学类型和远处转移无关，DSN1高表达三阴性乳腺癌患者肿瘤显示出更高的恶性程度。本研究生存分析发现，DSN1高表达三阴性乳腺癌患者的预后低于DSN1低表达患者，Cox比例风险模型分析提示DSN1表达为患者无瘤生存率和总生存率独立预后因素。提示DSN1高表达是三阴性乳腺癌患者预后不良的独立危险因素，是可能预测三阴性乳腺癌预后新的分子标志物。亦有研究发现，乳腺癌HER2阳性和阴性的基因结构变化是不一致的,在HER2阴性的乳腺癌基因测序中能够明显发现DSN1基因扩增，推测有可能是DSN1基因扩增促进HER2表达阳性的改变发生[10]。这些为后续深入挖掘DSN1作为乳腺癌的生物靶标奠定了基础。

表2 三阴性乳腺癌患者无瘤生存率预测因素的Cox比例风险模型分析

表3 三阴性乳腺癌患者总生存率预测因素的Cox比例风险模型分析

DSN1高表达和三阴性乳腺癌患者不良预后相关的机制尚不清楚，其可能机制为染色质的不稳定导致细胞遗传物质的不稳定。染色体分离过程出现异常或染色体错配则会导致多倍体或突变发生，即出现基因不稳定性[11,12]，这是肿瘤发生和进展的重要原因。调控动粒蛋白能对肿瘤的生长、凋亡、侵袭转移造成重大影响[13～15]。DSN1缺乏的肿瘤细胞能够观察到染色体错位和有丝分裂延迟；DSN1敲除的肿瘤细胞仍然能够存活，但其恶性细胞的增殖、迁移、侵袭能力大大下降[16]。DSN1在三阴性乳腺癌方面的机制是否涉及有丝分裂或其他特定机制需要进一步研究。

综上可见，DSN1在三阴性乳腺癌组织中高表达，且与患者TNM分期和淋巴结转移密切相关；DSN1高表达是三阴性乳腺癌预后不良的独立危险因素，可能是预测三阴性乳腺癌预后新的分子标志物。但本研究纳入样本量少，存在一定局限性，DSN1影响三阴性乳腺癌患者预后的分子机制尚需要进一步研究。