传统发酵东北酸菜中植物乳杆菌HUCM115的分离及益生特性

国立东，张文文，刘 艳，黄梦玲，门 悦，张燕丽，王丽群

（1.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学实验实训中心，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江省农业科学院食品加工研究所，黑龙江 哈尔滨 150086）

传统发酵食品往往因独特的风味、口感甚至特有的营养价值而在人类食品中占有重要地位，既包括奶酪、酸奶、开菲尔以及发酵香肠等动物性发酵食品，也包括酸菜、泡菜等植物性发酵食品。东北酸菜是我国东北地区人们以贮藏秋菜而在漫长冬季仍能摄取蔬菜为目的的产物之一，并已成为东北地区重要的一种特色传统发酵食品，可生熟两吃。传统东北酸菜主要以白菜为原料进行自然发酵，以口感酸爽、脆嫩，风味独特，富含多种氨基酸等特点于一身而闻名[1]，这与酸菜在自然发酵制备过程中微生物的组成及作用息息相关。酸菜的菌相组成主要源于附着在蔬菜表面的天然本土微生物，其与地域环境有关，因此东北地区的气候及环境条件赋予了东北酸菜特有的风味及营养价值。传统发酵酸菜的微生物菌群涵盖了细菌和真菌两大类，且以细菌占绝对优势，而细菌中又以乳酸菌为优势菌，主要包括乳杆菌属、明串珠菌属等。乳酸菌作为益生菌的重要来源而备受关注，并成为研究热点。大量动物及人体临床研究表明，乳酸菌具有诸多明确的益生功能，如可降胆固醇[2]、抗糖尿病[3]、抗肥胖[4]、抗抑郁[5]、抗氧化[6]、可降解草酸盐防治肾脏疾病[7]等，这些益生特性具有菌种和菌株特异性[8]。因此，从传统自然发酵酸菜中分离筛选性状优良的具有潜在应用价值的乳酸菌具有重要意义。本研究从东北酸菜中分离筛选到1 株乳酸菌，通过形态学及基因序列比对分析对其种属进行鉴定，并探究其益生特性，旨在为益生菌产品的开发及工业潜在发酵剂菌种筛选提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

酸菜来源于黑龙江哈尔滨地区家庭，均采用传统自然发酵制作。

1.1.2 培养基

改良MRS（mMRS）培养基，参照文献[9]的方法配制。胰蛋白胨酵母膏葡萄糖（tryptone yeast glucose，TYG）液体培养基，参照文献[10]方法配制。

1.1.3 试剂

胆固醇 美国Amresco公司；牛胆粉 德国Merck公司；γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）美国Sigma公司；L-谷氨酸 国药集团化学试剂有限公司；细菌基因组提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；三乙胺、正己烷、乙腈均为色谱纯；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

1260 高效液相色谱仪 安捷伦（中国）科技有限公司；SW-CJ-2D超净工作台 苏州净化设备有限公司；DM2500显微镜 上海徕卡显微镜有限公司；SPX-200-II生化培养箱 上海跃进医疗器械厂；BXM-30R全自动高压灭菌锅 上海博讯实业有限公司；TGL-16离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集

使用无菌镊子及勺取酸菜及汁液样品于无菌离心管中，并放入冰盒立即带回实验室于4 ℃冰箱短暂保存，待分离乳酸菌。

1.3.2 乳酸菌的分离

当天采集的酸菜样品用无菌生理盐水重悬，适当梯度稀释后涂布于含0.75% CaCO3的mMRS固体培养基上，37 ℃培养48 h，挑取周围形成透明圈的菌落进行纯化，革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的菌株初步确定为疑似乳酸菌。

1.3.3 菌株的鉴定

记录疑似乳酸菌分离株的菌落及菌体细胞特征，参照文献[9]的方法进行16S rDNA基因的扩增、测序，并通过MEGA5.1软件与乳杆菌属内模式菌株的16S rDNA基因序列进行比对分析，构建系统发育树，并结合pheS基因序列构建的系统发育树进行种间与种内的鉴定，pheS基因扩增引物及聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）条件参照文献[11]。

1.3.4 酸与胆汁耐受性测定

通过pH 2.0、2.5和pH 3.0酸性环境，或0.3 g/100 mL和0.5 g/100 mL牛胆汁胁迫环境下菌株的存活情况分别评价菌株的酸和胆汁耐受性。传代3 次活化的菌株经发酵培养后离心获取菌泥，分别用与发酵液等体积不同胁迫环境条件的mMRS液体培养基继续培养3 h，用平板菌落计数法分别检测0、1、2、3 h的活菌数，从而确定其对酸或胆汁的耐受能力。

1.3.5 自动聚集能力测定

菌株自动聚集能力评价参照文献[12]方法，以自动聚集百分比表示。菌株在mMRS液体培养基中培养24 h后，培养物旋涡振荡2 min，取1 mL检测细菌悬浮液在600 nm波长处的吸光度（A0），随后室温静置，分别于振荡后30、60、90、120、150 min取1 mL上层清液测定600 nm波长处吸光度，记为At。不同时间点菌株自动聚集百分比计算如式（1）所示：

1.3.6 体外降胆固醇特性的检测

菌株经mMRS液体培养基活化后，按1%接种至含0.3 g/100 mL牛胆汁和100 μg/mL胆固醇的mMRS液体培养基中，37 ℃培养24 h后离心获取上清液，采用邻苯二甲醛法[13]分别检测接种前后培养基中胆固醇含量，并按式（2）计算菌株的胆固醇去除率[14]：

式中：C0为未接种乳酸菌培养上清液胆固醇质量浓度；C1为接种乳酸菌培养上清液胆固醇质量浓度。

1.3.7 发酵液中GABA的测定

菌株在mMRS液体培养基中传代3 次活化后，按1%接种至含1%谷氨酸的TYG液体培养基中，37 ℃培养48 h，发酵液上清液经0.22 μm滤膜过滤后供GABA检测分析。GABA检测采用异硫氰酸苯酯柱前衍生反相高效液相色谱法，衍生化处理及色谱条件参照文献[15]。

1.4 数据分析

数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析，应用单因素方差分析进行组间比较，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与鉴定

2.1.1 菌株的分离

采集的传统自然发酵酸菜样品经mMRS选择性培养基分离筛选，共分离到可在含0.75% CaCO3的mMRS固体培养基上形成透明圈菌落、革兰氏阳性且过氧化氢酶阴性的疑似乳酸菌9 株，分离结果如图1所示。生长速度是筛选工业发酵剂菌种的重要指标之一，故选取了其中1 株在液体培养基中生长速度最快的菌株HUCM115进行深入研究。

图1 酸菜样品中乳酸菌的分离Fig.1 Flow chart of isolation of lactic acid bacteria from traditional pickled Chinese cabbage

2.1.2 形态学特征

菌株HUCM115在mMRS固体培养基和液体培养基分别于37 ℃培养24 h，其生长情况及革兰氏染色观察菌体细胞的形态特征如图2所示。菌株HUCM115在mMRS琼脂培养基上形成为圆形，表面光滑有光泽，边缘完整，低凸，质地黏稠，乳白色，菌落不透明；菌体细胞为短杆，两端钝圆，单在、成对排列，偶见成链；液体培养24 h呈混浊生长，但上层较澄清，底部有厚层沉淀，上下层界限明显。

2.1.3 16 S rDNA序列比对分析

菌株HUCM115的16S rDNA基因经PCR扩增、纯化并测序，其16S rDNA基因序列经BLAST后发现与乳杆菌属内菌种的同源性最高。利用MEGA5.1软件，与GenBank数据库中已知的乳杆菌属内模式菌株的16S rDNA基因序列进行序列比较，并以非同属的Escherchia coli模式菌株为外标，绘制出系统发育树，结果如图3所示。

图3 基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

由图3可知，菌株HUCM115与Lactobacillus plantarum和L.pentosus模式株的亲缘关系最近，序列相似性均大于98%，故通过16S rDNA基因序列比对分析尚无法确定菌株HUCM115的具体种。因此，选择pheS基因序列进一步比对分析。

2.1.4pheS基因序列比对分析

为了进一步确定菌株HUCM115种的归属，其pheS基因被进一步扩增及测序，经BLAST后发现其pheS基因序列同样与乳杆菌属内菌种的同源性最高。同样利用MEGA5.1软件，以非同属的Hellcobacter pylori模式菌株为外标，与已知的乳杆菌属内模式菌株的pheS基因序列进行比较分析，绘制系统发育树，结果如图4所示。

图4 基于pheS基因序列构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on pheS gene sequences

基于pheS基因序列构建的系统发育树显示，菌株HUCM115与L.plantarum模式株的亲缘关系最近，且序列相似性为100%。

因此，鉴于形态学特征及16S rDNA和pheS基因序列比对分析结果，可确定HUCM115菌株为植物乳杆菌。

2.2 菌株HUCM115的酸耐受性

图5 植物乳杆菌HUCM115在酸性环境下的存活情况Fig.5 Viability of L.plantarum HUCM115 under acidic conditions

菌株HUCM1115分别在pH 2.0、2.5和pH 3.0环境下37 ℃培养3 h，不同培养时间活菌数变化情况如图5所示。在pH 3.0和pH 2.5酸性环境下保持3 h前后活菌数无显著变化（P＞0.05），仍维持在109CFU/mL水平；pH 2.0酸性环境对菌株HUCM115的存活影响较大，培养1 h后活菌数从1.9×109CFU/mL降为8.4×107CFU/mL，而培养2 h后则无活菌检出。

2.3 菌株HUCM115的胆汁耐受性

图6 胆汁对植物乳杆菌HUCM115存活力的影响Fig.6 Effect of bile on the viability of L.plantarum HUCM115

如图6所示，不论在0.3 g/100 mL还是0.5 g/100 mL胆汁环境下，菌株HUCM115培养1、2、3 h后活菌数与0 h相比均无显著差异（P＞0.05），这说明菌株HUCM115处于胆汁质量浓度低于0.5 g/100 mL环境时，其菌种活力不会受到任何影响。

2.4 菌株HUCM115的自动聚集能力

图7 植物乳杆菌HUCM115的自动聚集能力Fig.7 Auto-aggregation capacity of L.plantarum HUCM115

由图7可知，植物乳杆菌HUCM115培养物经振荡后发生了迅速沉降，室温静置30 min自动聚集百分比为15.4%，而静置60 min则达到近70%，此时细菌悬浮液上层溶液呈澄清状态，之后自动聚集百分比则趋于平稳无显著变化，到第150分钟时自动聚集百分比为72.4%。

2.5 菌株HUCM115体外去除胆固醇作用

未接种与接种植物乳杆菌HUCM115的含胆固醇培养基于37 ℃培养24 h后，分别测定培养上清液的胆固醇含量，结果如表1所示。植物乳杆菌HUCM115培养在含胆固醇培养基中24 h后，培养基中20.6%胆固醇被去除，说明该菌株具有潜在的降胆固醇特性。

表1 植物乳杆菌HUCM115的胆固醇去除能力Table 1Cholesterol-removal ability of L.plantarum HUCM115

2.6 菌株HUCM115产GABA的能力

在富含谷氨酸的培养基中，接种菌株HUCM115培养48 h后，用高效液相色谱法检测发酵液中GABA含量，色谱如图8所示。利用外标法以峰面积进行定量可知，植物乳杆菌HUCM115于37 ℃培养在含1%谷氨酸的TYG培养基中，孵育48 h后发酵液中GABA质量浓度可达（101.3±0.8） μg/mL。

图8 植物乳杆菌HUCM115发酵液（A）及GABA标准品（B）的高效液相色谱图Fig.8 HPLC profiles of fermented broth of L.plantarum HUCM115 (A)and GABA standard (B)

3 讨 论

东北酸菜是一种赋有地域特色的传统发酵食品，具有悠久的食用历史，集独特的风味、口感、营养于一身，这与其富含的优势菌群密切相关，从采集的传统自然发酵酸菜中分离筛选到1 株具有绝对生长优势的植物乳杆菌，并对其益生特性进行研究。乳酸菌体内发挥益生功能的前提是能耐受胃液和胆汁胁迫，并以相当数量活菌黏附定植到肠道。人体空腹时胃液酸度通常为pH 1.0～2.0，摄食后则会上升至pH 5.0以上，食物在胃内消化时间大约为2～4 h[16]，故选取pH 2.0、2.5和pH 3.0三种酸性环境处理3 h评价植物乳杆菌HUCM115的酸耐受能力，其在pH 3.0酸性环境维持3 h活菌数无变化，而pH 2.0和pH 2.5环境下活菌数出现不同程度降低，尤以pH 2.0影响最大，故该菌株及其制剂适宜餐后摄入。胆汁可使细菌细胞膜溶出从而起到抗菌作用[17]，其肠道内生理含量通常为0.5%[18]，而植物乳杆菌HUCM115对其展现出了明显抗性。乳酸菌的自动聚集能力与其黏附性正相关，可作为益生菌黏附能力筛选指标之一[12,19]，菌株HUCM115的自动聚集能力强于商业化菌株鼠李糖乳杆菌GG和嗜酸乳杆菌NCFM[12]。由此说明，植物乳杆菌HUCM115具备耐受胃液和胆汁胁迫并黏附到肠道的潜能。

人体血清胆固醇水平过高是引发心血管疾病的重要危险因素，动物及人体临床研究已证实乳酸菌具有降胆固醇作用[20-21]，通常情况下体外可去除胆固醇的乳酸菌在体内也会表现出良好的降胆固醇作用[22-23]，因此体外筛选降胆固醇乳酸菌具有重要意义。乳酸菌对胆汁的耐受性与其胆酸盐水解酶（bile salts hydrolase，BSH）活性有关[24-25]，并可通过BSH活性机制实现体外/体内降胆固醇作用[2,26]，故推测高胆汁抗性的菌株HUCM115可能具有BSH活性进而降胆固醇，结果显示植物乳杆菌HUCM115可将培养基中1/5的胆固醇去除，其胆固醇去除能力与Li Yang等[22]报道的植物乳杆菌相当，但其体外去除胆固醇的确切机理仍需进一步研究确定。

GABA的产生有利于维持微生物细胞内pH值的稳态平衡，从而使其可耐受酸胁迫环境[27]，研究发现乳酸菌具有谷氨酸脱羧酶活性可催化L-谷氨酸脱羧生成GABA[28]，故对可耐酸的HUCM115菌株产GABA能力进行评价。GABA是一种在自然界分布广泛的非蛋白质氨基酸，为一种抑制性神经递质，可抑制血压升高、减少抑郁的发生等[29-30]，这表明可产GABA的植物乳杆菌HUCM115在降血压及缓解抑郁等方面可能具有一定的潜在价值。总之，植物乳杆菌HUCM115可作为候选益生菌株用于体内实验研究以深入探究其益生功能及机制。

4 结 论

从东北酸菜中分离到1 株植物乳杆菌HUCM115，具有良好的酸和胆汁耐受性及自动聚集能力，37 ℃发酵24 h后培养基中胆固醇去除率可达20.6%，发酵48 h后GABA质量浓度可积累至101.3 μg/mL，展现出了优良的益生特性，具有潜在的应用价值。