TYP-5猪冷冻精液试剂使用方法

文│金穗华［农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心（南京）］

猪冷冻精液可以长期保存，能显著提高种公猪利用率，扩大其基因传播范围，同时也是猪遗传资源生物技术静态保存的主要方法之一。在猪冷冻精液生产过程中，选择合适的冷冻保护剂对改善解冻后精子复苏率、活力、顶体完整率、存活时间、畸形率等精液质量指标至关重要。

自制猪冷冻精液试剂简单方便，可以按照需要的数量随时配制。自制试剂大多使用BTS（beltsville thawing solution）配方，该配方为EDTA 0.125克，柠檬酸三钠0.6克，氯化钾0.075克，碳酸氢钠0.125克，葡萄糖3.7克，青霉素钠0.06克，硫酸链霉素0.1克，纯化水100毫升。应用BTS配方生产的冷冻精液解冻后精子复苏率达到50%左右，顶体完整率能达到40%。

国内市面上效果较好、使用较多的猪冷冻精液保护剂为TYP-5田园奥瑞猪冻精试剂套装。TYP-5田园奥瑞猪冻精试剂套装2018年上市，性能稳定高效，所生产的猪冷冻精液复苏率达到70%～90%，顶体完整率60%～80%，广泛应用于猪冷冻精液商品化生产和地方品种猪冷冻精液保种。冻精试剂的正确使用方法和步骤至关重要，使用不当可能导致精子“全军覆没”。

一、TYP-5猪冷冻精液试剂介绍

1.TYP-5猪冷冻精液试剂组成。TYP-5猪冷冻精液试剂套装含有A、B、C、D、E五种精液冷冻不同阶段的成分，分别为：A为预稀释剂、B为冷冻冷藏基础营养液、C和D为冷冻辅助剂、E为解冻剂。B+蛋黄对应为冷藏保护剂、B+C+D+蛋黄对应为冷冻保护剂。其中，预稀释剂和解冻剂为冷冻精液专用，有别于常温猪精液稀释粉（表1）。

表1 TYP-5猪冷冻精液试剂套装组成表

二、TYP-5猪冷冻精液试剂使用方法

1.采精预稀释。将猪冻精试剂A溶于1升双蒸水中，充分混匀，预热至37℃，将鲜采原精稀释一倍。一袋猪冻精试剂A稀释3～4头份种公猪精液。同时，检测原精质量，记录密度、体积、活率（运动精子率）、活力（前向运动精子率）和畸形率，用于冻精的精液活率应在90%以上，活力在80%以上，畸形率在10%以下。（每袋猪冻精试剂A拆开后为成分不同、质量也不相同的A1和A2两小包，必须同时使用）。

2.将稀释后的鲜精于室温（25℃）静置1小时，转入17℃恒温箱，平衡2～3小时，最长不超过24小时。有条件的推荐使用程控平衡仪，可以程序化精准控制降温温度、降温时间、降温速率等。

3.将一瓶猪冻精试剂B溶于400毫升双蒸水中，充分溶解，制成基础液，稀释6～8头份种公猪精液。

4.取新鲜鸡蛋，去蛋清，将完整蛋黄置于灭菌无绒吸水纸上，将剩余蛋清吸净，用注射器抽取蛋黄100毫升，加入配好的基础液中，充分混匀，制成I液。

5.取I液276毫升，加入猪冻精试剂C（18毫升），猪冻精试剂D（6毫升），制成Ⅱ液300毫升。

6.将I液置于17℃、Ⅱ液置于4℃恒温箱冷藏，待用。

7.鲜精充分平衡后，摇匀，防止精子假死，17℃条件下800～900克离心10～15分钟，去掉上清液。离心前记录离心瓶重W0（克），去上清后，离心瓶加精子重W1（克），估得精子体积V1（毫升）=W1-W0。

笔者提出了一种新型综掘巷道新型超前支护设备，具有高度和宽度可伸缩调整、适应不同巷道截面尺寸等功能，并利用特殊结构处理的伸缩梁与顶梁，使得支架在展开时能够与顶板良好接触。同时论述了该装备的关键组成部分，即超前支架的结构及工作原理，并进行了应力分析，分析的结果为综掘巷道超前支护提供了技术支撑。

8.用17℃的I液重悬浮精子，使精子密度达到20亿/毫升。在离心较为彻底的情况下可以忽略上清中的精子，但若离心不彻底，上清精子较多，则总精子应该减去上清中的部分，即加入I液的体积V2＝原精总精子数（亿）-上清液体积（毫升） ×上清液精子密度（亿/毫升）/20（亿/毫升）-V1（毫升）。若精清分离不彻底，可能会使V2/V1过小，甚至出现负值，影响精液后续的降温，此时应调低冻精目标密度，或者重新离心，使得V2/V1≥1。

9.I液重悬浮后的精子置于盛有17℃水的烧杯中，于4℃冰箱或低温操作柜中降温平衡，注意用温度计监测温度，使精液在2.5～3小时缓慢降温至4～5℃，并在4～5℃平衡0.5～1小时。有条件的推荐使用程控平衡仪，可以程序化精准控制降温温度、降温时间、降温速率等。

10.精液在4℃平衡后，加入Ⅱ液，稀释一倍，其体积V3＝V1+V2。混匀后立即在低温操作柜中进行0.5毫升细管灌装操作，并在细管托架上码好。

11.在精液进行0.5毫升细管灌装的同时启动程序冷冻仪，将腔室温度降至4～5℃。另一边同时将两个水浴锅分别设置50℃和30℃（26～32℃），并按照需要量每20毫升双蒸水溶解1克猪冻精试剂E，于30℃（26～32℃）水浴锅预热备用。

12.灌装完毕后，迅速将码好的细管精液放入冷冻仪中，设置猪冷冻精液降温曲线，启动冷冻程序，待程序跑完后取出冷冻精液细管浸入液氮中。冷冻降温速率控制在4℃至1℃为1.5℃/分钟，1℃以后降温速率达到-30℃/分钟。如果使用熏蒸法手工制作，精液细管所在位置温度控制在-120～-80℃。

三、TYP-5猪冷冻精液解冻剂使用方法

1.每头猪至少取2支细管解冻进行检测。细管在50℃解冻16秒，剪去细管两端，将精液移入4毫升离心管中，用预热好的解冻稀释液稀释。

2.冷冻精液在3 0℃（26～32℃）恢复15～20分钟后在显微镜下检测冻精解冻后质量。同时，根据解冻情况决定精液是否留存。

3.将决定留存的精液装入拇指管和纱布袋中，转入液氮罐储存，并做好标记。标记信息至少包括日期和猪号。

4.输精时，解冻精液用配好的解冻稀释液稀释约10倍，在30分钟内进行子宫深部输精，建议一个输精剂量的有效精子总数不低于同等条件下的鲜精有效精子总数。

四、TYP-5猪冷冻精液试剂保存

1.储存环境最好为阴凉干燥，避免高温和潮湿。长期储存2～8℃；短期储存于室温保存。

2.有效期。6个月。

五、TYP-5猪冷冻精液试剂使用注意事项

1.冻精试剂开封后尽快使用。

2.避免高温和反复冻融。

3.使用新鲜鸡蛋卵黄。

4.猪冻精试剂D冷藏会出现结晶，使用前可用30～40℃温水加热使之重新溶解。

受非洲猪瘟疫情及新冠肺炎疫情影响，猪鲜精运输调配受阻和生物安全隐患影响到生猪生产的繁殖需求，猪冷冻精液长期保存的特点恰好可以有效弥补繁殖的短板。目前，猪冷冻精液技术研究越来越多并逐步进入商品化生产应用阶段，科学配制更优化的冷冻精液试剂配方，提高精子抗氧化和抗冻耐冻能力，改善精子冻后活力质量，有助于猪冷冻精液的推广应用，对加快恢复生猪生产、大力推动养殖业转型升级具有重要意义和重大价值。