高效液相色谱-蒸发光散射法分析海鲈肌肉磷脂组成

王 霞，林婉玲，李来好，吴燕燕，杨少玲，黄 卉, 杨贤庆，林 织

(1.中国水产科学研究院 南海水产研究所，国家水产品加工技术研发中心，农业农村部水产品加工重点实验室，广州 510300； 2.广东药科大学 公共卫生学院，广州 510006； 3.广东顺欣海洋渔业集团有限公司，广东 阳江 529800)

海鲈(Lateolabraxjaponicus)又称鲈鱼、花寨和板鲈，分布于渤海至南海近岸及通海的江河水域，生长周期快、适应性广，是我国重要的海水养殖鱼类[1]。海鲈肉质鲜美、清香，含有丰富的蛋白质和微量元素[2-3]，此外还含有丰富的磷脂。磷脂是生物膜的重要组成部分，作为膜的结构物质和功能单位，以规律的结构保证细胞的正常形态和功能，还是脂类依赖性酶类起催化作用时不可缺少的物质。衰老和多种结构的改变也与膜磷脂的改变有关。磷脂的补充在抗衰老，防治动脉粥样硬化、肝硬化、皮肤病、血液病，调节血糖，促进骨折愈合，调节神经功能及开发智力等方面均有较强的作用[4-5]。目前，有关海鲈的研究主要集中在产品加工工艺[6-7]、理化特性[8]、饲料喂养[9-10]、副产品加工[11]和基本营养成分[12-13]等方面。而对于海鲈磷脂方面的研究较少，缺少海鲈磷脂组成检测方法的研究，不利于海鲈的进一步开发利用。

目前，关于磷脂检测的常用方法有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和核磁共振法(NMR)[14]。TLC适用于不同类别间磷脂的分离，简便、直观，但预处理比较烦琐、耗时，对准确度影响较大。HPLC可以用于磷脂类别间和类别内的分离，有利于复杂样本的定性和定量分析[15]。NMR可以定性定量分析，具有快速、准确性高的优点，但是样本用量较大[16]。目前，HPLC是磷脂定性定量研究的主要方法。由于磷脂结构中包含1个极性的磷酸头部基团和1～2个非极性脂肪酰基尾部基团，且根据极性头部基团的差异，磷脂呈现不同种类[17]，等度洗脱难以完全分离，梯度洗脱较适合于磷脂分离，会获得较好的峰形和分离度，紫外和示差折光检测器不适合梯度洗脱，蒸发光散射检测器(ELSD)能消除因梯度洗脱和流动相给分析检测带来的影响[14]。常用的流动相有正己烷-异丙醇-乙酸和氯仿-甲醇-水/氨水两种体系，其中氯仿-甲醇-水/氨水体系噪声信号较高，不适合ELSD检测，应选择正己烷-异丙醇-乙酸体系[18]。因此，本实验以海鲈为研究对象，选择高效液相色谱-蒸发光散射法，采用正己烷-异丙醇-乙酸体系，梯度洗脱，对海水鱼海鲈肌肉磷脂组成进行分析测定，以期为海鲈的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

海鲈(1.8 kg)，广州市南沙市场；溶血磷脂酰乙醇胺(LPE，纯度>99%)、磷脂酰乙醇胺(PE，纯度>98%)、磷脂酰丝氨酸(PS，纯度>98%)、磷脂酰肌醇(PI，纯度>98%)、磷脂酰胆碱(PC，纯度>98%)、鞘磷脂(SM，纯度≥98%)、溶血磷脂酰胆碱(LPC，纯度>98%)，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，美国Sigma公司；正己烷、异丙醇均为色谱纯，广州华屿欣实验器材有限公司；氯仿、甲醇、丙酮均为分析纯，东莞市宏都化工有限公司。

1.1.2 仪器与设备

LC-20AD高效液相色谱仪、ELSD-LTⅡ蒸发光散射检测器、QP2010 plus气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪，日本岛津公司；BS 224S电子天平，德国Sartorius公司；TDZ5-WS台式低速离心机，中国湖南湘仪离心机公司；氮吹仪，美国Organmation公司。

1.2 实验方法

1.2.1 海鲈肌肉脂类物质的提取

取新鲜海鲈的可食用部分肌肉，去皮后用生理盐水冲洗，均质机打碎后待处理。按照Folch等[19]的方法，使用氯仿-甲醇法提取脂质。精密称取绞碎鱼肉放入50 mL离心管中，加入15 mL氯仿-甲醇(体积比2∶1)溶液(含0.01%BHT)，在冰浴条件下用均质机均质2次(10 000 r/min，2×15 s，间隔30 s)，再加入15 mL氯仿-甲醇溶液，然后静置1 h后过滤，将全部滤液移到已知质量的离心管中，加入0.2倍体积的0.85%生理盐水，然后用离心机进行离心(3 000 r/min，15 min)，将分离的下层脂质溶液通过氮吹进行浓缩，冷却至恒重称量，得到海鲈肌肉脂类物质，计算其粗脂肪含量。

1.2.2 海鲈肌肉磷脂的纯化

使用氯仿-甲醇法提取的脂类物质，一般为结合态脂类，除含有磷脂外，还有糖脂、胆固醇及胆固醇酯等物质，会干扰磷脂检测，所以样品在进行分析前需要纯化。因为磷脂难溶于丙酮，因此将丙酮(4℃)加入脂类物质中，离心(4 000 r/min，7 min)除去上清液，反复多次，直至上清液无色，然后氮气吹干后得到海鲈肌肉磷脂，于-20℃冷冻保存备用。

1.2.3 海鲈肌肉磷脂脂肪酸组成分析

将三氟化硼-甲醇溶液加入海鲈肌肉磷脂进行甲酯化后，根据GB 5009.168—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》，测定样品磷脂脂肪酸组成。

1.2.4 海鲈肌肉磷脂组成测定

1.2.4.1 标准曲线的绘制

PE、PI、PS、PC、SM、LPC和LPE 7种标准品配制前储存在-20℃，配制(PI和LPE用氯仿溶解，其他用甲醇溶解)后放在4℃保存。将PE、LPE、PS、PI、PC、LPC和SM标准溶液分别单独进样进行HPLC-ELSD分析，记录各个标准品的出峰时间，依据保留时间对磷脂标准品进行定性。稀释不同质量浓度的混合标准品，从低质量浓度到高质量浓度进样，每个样品重复进样3次，以各个标准品质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.4.2 HPLC-ELSD分析条件

HPLC条件：Chromolith®Performance-Si 型正相硅胶色谱柱(100 mm×4.6 mm)；流动相A为正己烷(0.04%的三乙胺)，流动相B为异丙醇，流动相C为13%的乙酸溶液；柱温箱温度30℃；进样量20 μL[18]；采用三元梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1[20]。

表1 梯度洗脱程序

ELSD条件：雾化气体为氮气，气体压强320 kPa，漂移管温度70℃。

1.2.4.3 样品测定

取适量海鲈肌肉磷脂样品，溶解于甲醇，经 0.22 μm有机相滤膜过滤进样品瓶，按1.2.4.2进行HPLC-ELSD分析。以保留时间定性，将各峰面积代入标准曲线方程中，计算海鲈肌肉磷脂各组成含量。

1.2.5 数据处理

每个样品有3个平行，结果均表示为“平均值±标准差”，并用Excel软件绘图。

2 结果与讨论

2.1 海鲈肌肉粗脂肪含量与磷脂脂肪酸组成

采用氯仿-甲醇法提取脂质，得到海鲈肌肉粗脂肪含量为(10.86±0.73)%。海鲈肌肉磷脂脂肪酸组成及相对含量见表2。

表2 海鲈肌肉磷脂脂肪酸组成及相对含量

由表2可知，海鲈肌肉磷脂中含有10种脂肪酸，主要有棕榈酸、硬脂酸、亚麻酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸(DHA)，其中二十碳五烯酸(EPA)和DHA总含量占总脂肪酸的30.86%。EPA和DHA能够降低心血管疾病发生的概率，可改善视力，能够有效降低重度抑郁症和躁郁症的发病率[21]。海鲈肌肉磷脂中含有大量的不饱和脂肪酸，占总脂肪酸的62.59%。不饱和脂肪酸能够对心血管系统起到积极作用，如缓解血栓，且能够增强记忆力以及预防阿尔茨海默病，还可以提高免疫力等[22-24]。海鲈肌肉磷脂脂肪酸能够满足人体营养需求，有较高的营养价值。

2.2 海鲈肌肉磷脂组成

2.2.1 磷脂标准曲线

7种磷脂混合标准品的HPLC-ELSD图谱见图1，海鲈肌肉磷脂的HPLC-ELSD图谱见图2。

由图1及图2可知，在本实验的洗脱条件下，磷脂混合标准样品和海鲈肌肉磷脂样品均能达到基线分离，峰形良好，且海鲈肌肉磷脂中未检出SM。按照1.2.4.1，绘制标准曲线，各磷脂标准曲线方程、线性范围及相关系数见表3。

图1 7种磷脂混合标准品的 HPLC-ELSD 图谱

图2 海鲈肌肉磷脂HPLC-ELSD图谱

表3 磷脂标准曲线方程、线性范围及相关系数(R2)

由表3可知，磷脂各组分质量浓度与峰面积线性关系良好，相关系数大于0.99。PE、LPE、PI的线性范围分别为0.4～2.0 mg/mL、0.3～1.5 mg/mL和0.08～0.4 mg/mL。PS、PC、SM、LPC的线性范围均为0.1～0.5 mg/mL。

2.2.2 精密度实验

磷脂混合标准品重复进样3次，得出各磷脂组分相应峰面积的平均值和变异系数，结果见表4。

表4 磷脂标准品峰面积的精密度

由表4可知，磷脂标准品各组分峰面积变异系数均小于3%,重现性好。

2.2.3 回收率实验

称取相同质量的海鲈肌肉4份，每份3 g。其中3份加入已知质量的磷脂标准品，1份不加，涡旋处理，配成新样品，根据1.2.1和1.2.2方法制备海鲈肌肉磷脂样品，按1.2.4.3进行测定，每份样品平行测定3次，计算磷脂加标回收率，结果见表5。

表5 磷脂的加标回收率

从表5可以看出，7种磷脂加标回收率范围在86.00%～105.00%，相对标准偏差(RSD)小于3.50%，有较好的准确度。

2.3 海鲈肌肉磷脂组成(见表6)

从表6可以看出，海鲈肌肉包含6种磷脂组分，其含量高低顺序为PE>PC>PI>LPE>LPC>PS，SM未检出。PE具有抗氧化作用，可用于美容、保护心血管等；PC是重要的膜结构成分，具有特有的生物活性和生理功能，能够促进和改善大脑组织和神经系统的功能，提高记忆力，防治老年痴呆，治疗溃疡性结肠炎等[25-26]。

3 结 论

通过高效液相色谱-蒸发光散射法测定海鲈肌肉磷脂组成，选择流动相正己烷-异丙醇-乙酸体系得到的峰形良好，能够完全分离，且精密度和加标回收率满足实验要求，其中精密度高，变异系数均小于3%，加标回收率为86.00%～105.00%，相对标准偏差小于3.50%，能够快速、高效检测磷脂组成。本实验方法对于海水鱼磷脂测定，分离效果良好，可运用于其他海水鱼磷脂组分测定。

海鲈肌肉磷脂不饱和脂肪酸含量为62.59%，EPA和DHA总含量达30.86%，海鲈肌肉中共检出6种磷脂组分，其中PE、PC和PI含量较高，可对人体健康起到积极作用，利于人体均衡膳食摄入。