放置时间对人类白细胞抗原-B27检测结果准确性的影响

严海东, 王 珂, 高海珍

(1. 江苏省江阴市中医院 检验科, 江苏 无锡, 214400; 2. 东南大学医学院附属江阴医院 检验科, 江苏 无锡, 214400)

强直性脊柱炎(AS)是一种主要累及骶髂关节、脊柱的慢性炎症性疾病，会导致不可逆的脊柱生理结构性破坏，而早期诊断对改善患者预后十分关键[1]。研究[2]显示，人类白细胞抗原(HLA)-B27与AS具有很强的相关性, 80%～95%的AS患者HLA-B27表达呈阳性[3]，因此HLA-B27的检测结果对该病的诊断有重要意义。目前检测HLA-B27的方法较多，其中流式细胞术(FCM)的操作简便、省时，能在短期内完成，在实验室中应用较为广泛[4]。作者在工作中发现，一些外院送检标本的荧光强度多处于临界范围，难以准确判断结果，而本院标本则较少出现此种情况。标本的运送及保存条件、放置时间及检测的时效性等均可能影响标本的荧光强度，进而影响检测结果，现分析如下。

1 资料与方法

1.1 仪器与试剂

门诊新鲜采集的EDTA-K2抗凝血标本。BD FACSCalibur流式细胞仪及相应配套试剂，操作步骤严格按照操作说明书。

1.2 方法

1.2.1 染色后放置时间对检测结果影响的实验设计: 取新鲜采集的EDTA-K2抗凝血标本共30份，采血后立即进行预处理，将血标本反复颠倒混匀后取100 μL加入60 μL HLA-B27 FITC/CD3 PE双色荧光抗体，混匀，于室温下避光孵育20 min; 随后加入4 mL红细胞裂解液，混匀后室温下避光放置10 min; 待红细胞充分裂解后, 1 500转/min离心5 min, 弃去上清液，加入Cell Wash液4 mL轻轻洗涤并再次以1 500转/min离心5 min, 弃去上清，加入1 mL Cell Wash液轻轻混匀，立即上机检测。检测完毕后，将染色好的标本立即放入4 ℃冰箱保存，在保存0、20、40、60、80、100、120、180、300 min时上机进行检测。

1.2.2 不同的标本放置时间对检测结果影响的实验设计: 立即将血样放置在4 ℃冰箱保存，在0 min及1、2、4、8、24、48 h取出血样按1.2.1相关步骤进行荧光染色并立即上机检测，每个染色标本重复检测3次，取平均值作为最终检测结果。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析，组间比较采用配对t检验，相关性分析采用一元线性相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 染色后放置时间对检测结果的影响

染色后放置0、20、40、60、80、100、120、180、300 min时通过荧光1检测通道(FL1)检测出的平均荧光强度值分别为(139.7±27.1)、(136.6±26.2)、(133.2±26.3)、(130.9±25.3)、(128.7±25.4)、(127.3±25.1)、(126.2±24.6)、(122.4±24.0)、(116.6±22.1)。结果显示，随着放置时间的延长，标本平均荧光强度逐渐下降，且平均荧光强度的衰减与时间相关，相关方程为y=-0.073x+136.4(y为平均荧光强度，x为时间),R2=0.927, 见图1。

图1 平均荧光强度值与染色后放置时间的关系图

2.2 不同的标本放置时间对检测结果的影响

结果显示，血样放置0 min及1、2、4、8、24、48 h时平均荧光强度值分别为(139.7±27.1)、(140.0±26.9)、(140.1±27.3)、(139.0±26.9)、(140.3±26.0)、(139.0±27.7)、(135.1±26.4), 其中血样放置48 h时结果与新鲜标本(放置0 min)结果比较，差异有统计学意义(P<0.05), 考虑与血样中白细胞开始死亡且不再表达HLA-B27有关，提示血样放置24 h内对检测结果的影响不大，放置时间过长则会影响检测结果准确性。

3 讨 论

HLA-B27基因是一种主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)类基因，存在于几乎所有的有核细胞膜上，其中以淋巴细胞上所携带的HLA抗原最为丰富。目前检测HLA-B27的方法较多，有补体依赖细胞毒测定法(CDC)、玫瑰花结法、流式细胞术(FCM)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSO)、等电聚焦法(IEF)等[5]。随着基因测序技术的发展，聚合酶链反应直接测序法(PCR-SBT)也被用于检测HLA-B27[6], 这些方法各有优缺点，如ELISA、CDC无需特殊仪器，一般实验室即可开展，但操作比较繁琐, IEF能进行HLA-B27亚型分型, FCM操作简便、省时，能在短期内完成检测。

影响流式细胞检测结果的因素较多，如抗体的用量、非特异结合、抗原抗体的反应温度及染色时间、死细胞[7]、溶血时间[8]、所检测样本T细胞表面的HLA-B27表达量[9]等。由于所用抗体为荧光标记抗体，存在荧光衰减[10], 而造成荧光衰减的原因很多，如温度、激发光的照射、制备系统中的某些化学成分等，随着时间的延长，标本的荧光强度会发生变化，进而影响到检测结果准确性。

本研究探讨血标本放置时间及染色标本放置时间对检测结果的影响，结果发现，在严格避光的前提下，随着时间的延长，染色标本的荧光强度不断下降。研究[11]认为标本染色后放置4 h对检测结果无影响，但本研究结果证明荧光强度是随时间延长而逐渐下降的。因此，在实际工作中，对于高于临界值的标本，可以直接报告阳性; 对于低于临界值的标本，特别是比较接近临界值的可疑阳性标本，一定要考虑时间影响，可将放置时间代入回归方程得出可能的初始荧光强度进行判断，或者重新处理后立即检测，以防漏检阳性标本。同时，血标本应在采集后24 h内检测，以保证检测结果的准确性。