核酸检测技术在山东省济南地区献血者血液筛查中的应用效果

李英莲

(山东省血液中心 检验科, 山东 济南, 250014)

经输血传播疾病的病原体检测“窗口期”是血液筛查中的难题，核酸检测可以有效缩短乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)的检测“窗口期”，提高输血安全性。美国自1994年开始研究用于血液筛查的核酸检测技术(NAT), 2001年9月美国食品和药物管理局(FDA)批准了首个用于原料血浆筛查的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)NAT试剂和HCV NAT试剂; 2002年2月FDA批准了首个用于检测供者全血样本的NAT试剂; 2005年，美国FDA开始强制要求血液中心和血液制品生产企业采用批准的NAT试剂盒进行血源筛查，强制进行NAT筛查的病毒有HIV-1和HCV[2]。为了解NAT在血液筛查中的应用效果，本研究分析2015—2017年山东省济南地区无偿献血者血液筛查情况，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 样本来源

收集2015年1月—2017年12月山东省血液中心采集的无偿献血者样本282 456份。每位献血者采血时分别留取3管血液标本，每管5 mL; 2管采用EDTA-K2真空抗凝管留取，第1管用于酶联免疫吸附试验(ELISA), 第2管用于谷氨酸转氨酶(ALT)及血型检测; 第3管采用带分离胶的EDTA-K2真空抗凝管(无酶、无热源)留取，用于NAT检测。核酸检测管于采血后4 h内完成离心, 2～8 ℃冰箱保存, 48 h内进行核酸检测。

1.2 仪器与试剂

STAR全自动加样仪(瑞士Hamilton公司), FAME酶免全自动检测分析仪(瑞士Hamilton公司), S201全自动核酸检测系统(美国罗氏诊断)，上海浩源核酸检测系统。ELISA检测试剂(法国伯乐、美国雅培、上海科华、厦门新创、北京万泰、珠海丽珠、北京金豪)，核酸联合检测试剂(美国罗氏诊断公司，上海浩源公司)。

1.3 方法

1.3.1 ELISA: 使用2种 ELISA试剂进行检测, 2种试剂均无反应性判为无反应性, 2种试剂均有反应性判为有反应性; 若仅有1种试剂有反应性，则使用2种试剂做双孔复试，复试结果只要有1孔为反应性就判为有反应性。

1.3.2 NAT检测: 采用核酸提取扩增检测系统对ELISA无反应性与单试剂反应性样本进行6混样(罗氏诊断)或者8混样(上海浩源)模式检测，检出的反应性混样做拆分试验，单检结果为反应性的样本为NAT反应性。

1.4 统计学方法

应用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，计数资料分别采用百分数和千分数表示，采用卡方检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2015—2017年济南地区无偿献血者血液样本ELISA检测结果

282 456份无偿献血者样本中，检测出1 638例ELISA[乙肝表面抗原(HBsAg)、抗丙型肝炎病毒(抗-HCV)、抗人类免疫缺陷病毒/人类免疫缺陷病毒(抗-HIV/HIV)]反应性样本，反应性检出率为0. 58%, 相邻2个年度检出率比较，差异有统计学意义(P<0.05), 见表1。

2.2 2015—2017年济南地区无偿献血者血液样本NAT检测结果

280 818份ELISA无反应性样本中，检测出NAT反应性105份，相邻2个年度检出率比较，差异无统计学意义(P>0.05), 见表2。

表1 2015—2017年济南地区无偿献血者血液样本ELISA检测结果比较

表2 2015—2017年济南地区献血者ELISA检测无反应性样本的NAT结果比较

3 讨 论

目前，中国血液筛查的NAT主要为逆转录介导的扩增技术(TMA)和实时荧光PCR技术[1], 研究[2]表明这2种核酸筛查系统的灵敏度、特异性和NAT阳性检出率均存在差异。核酸检测的基本步骤包括核酸提取、扩增和检测。本中心实验室使用的美国罗氏和上海浩源核酸检测系统均采用了聚合酶链反应的PCR技术，这种技术具有高敏感性、高通量和高度自动化的特点，可检出血样本中极微量的病毒核酸，可以将HBV、HCV和HIV检测的“窗口期”分别由56、70、22 d缩短至41、12、11 d[3]。本中心对 280 818份经2种ELISA试剂检测均无反应性的献血者样本进行HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA 3项联检，检出105例NAT反应性样本，阳性反应率为0.37‰, 低于上海的0.63‰[4]、重庆的1.06‰[5], 同时也低于本中心于2010—2012年检测的总反应性率0.67‰。

本研究中, HBV DNA 反应性献血者占据总NAT 反应性人群的98.10%, 作者分析原因可能为: ① 中国是乙肝感染大国，1～59岁人群HBsAg携带率达到了7.18%[6], 西部地区HBsAg携带率高于东部地区，由于不同地区的乙肝流行率不同，隐匿性乙肝病毒感染率自然也会存在差异; ② 不同厂家核酸试剂的检测灵敏度不同，导致检测结果存在差异; ③ 同一地区不同时间献血人群的乙肝病毒感染率也不同; ④ 本中心自2010年开始对济南地区部分献血者进行核酸检测，2012年实现全部献血者核酸检测，随着献血人群中的隐匿性乙肝感染者被检出屏蔽，逐步降低了隐匿性乙肝感染者参与献血的概率，尤其是减少了固定献血者中乙肝隐匿性感染者的人数。

研究[7]发现, 70%的HCV、90%的HBV及HIV漏检是由于检测“窗口期”导致的。本研究中, 2015与2016年、2016与2017年3个项目的ELISA反应性率均有显著差异，说明3个项目献血人群的感染率并不会随着时间延长而降低，而是不固定的，这种现象也与献血人群采前快检时查体工作人员的工作效果相关。若查体工作人员认真履行采前快速检测程序，对全部有意向献血者按照规程进行HBsAg快速检测，筛查出来的HBsAg反应性献血者自然会减少。HIV在血液中的标志物有HIV-Ab、HIV-Ag、HIV-RNA, 这3类标志物在感染者血液中出现的时间分别为22、(8～10)、7 d[8-10], 目前国内采供血机构的HIV筛查试验是以检出这3类标志物作为HIV反应性标准。2015年底，全国血站对HIV进行NAT 检测，进一步使HIV检测“窗口期”缩短至平均11 d(多样本混检)[11-13]。2017年，本中心检测出1例HIV ELISA无反应性而HIV RNA反应性的献血者，同样在2012年也检测出1例[14-15], 2例HIV ELISA“窗口期”HIV感染者的检出证实了核酸检测在HIV项目上的重要性和必要性。2017年，这例HIV RNA反应性献血者在检出之前已捐献血液117次，是一位固定献血者，最后这次捐献了2个单位的血小板，且距离上次捐献合格血液的时间仅有37 d, 进口HIV ELISA试剂和国产ELISA试剂检测均为无反应性，同样证实HIV RNA检测确实比第4代进口酶免试剂还要短。

本研究中, 2016年罗氏核酸检测系统检出1例HCV RNA反应性样本[循环阈值(Ct)为39.7], 同时也是HBV DNA反应性(Ct值为29.5), 该献血者为初次献血, HBsAg ELISA 检测结果S/CO为0.5(法国伯乐)、0.44(上海科华)，抗-HCV ELISA 检测结果S/CO为0.02(珠海丽珠)、0.07(北京万泰)，说明此人献血时正处于HCV ELISA检测“窗口期”，这是本实验室自2010年开展核酸检测以来检出的唯一1例HCV RNA反应性而抗-HCV无反应性的献血者。

综上所述, ELISA检测无反应性的样本，进口试剂和国产试剂都会出现假阴性，而NAT 检测可以缩短ELISA检测的“窗口期”，有效降低经输血传播疾病的风险。